1.一种检测miRNA的电化学生物传感器,其特征在于,在电极上依次修饰S1、RCA产物层;所述的RCA产物层中包括S、环形模板、AgMBs、miRNA-21;所述的环形模板为:5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA与连接探针Ligation probe通过分子内连接反应得到;
所用碱基序列如下:
miRNA-21碱基序列如SEQ No.1所示;具体为:5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’;
S碱基序列如SEQ No.2所示;具体为:5’-AACATCAGGCCG rA AGGCCTGTCC TCGTCCGGCTC GT TGATAAGCTA-inverted dT-3’;
Padlock DNA碱基序列如SEQ No.3所示;具体为:5’-P-AACAATTTGAACTTGTTAAAC GCTTCGTCCGGCTCGGA CTATTTGAATT CGGCCTGTT-3’;
Ligation probe 碱基序列如SEQ No.4所示;具体为:5’-TCAAATTGTT AACAGGCCGA-3’;
AgMBs碱基序列如SEQ No.5所示;具体为:5’-GTTCAAATTGTTAAAC rACTAATTGAATTTGG CCCTAACTCCCC-inverted dT-3’;
S1碱基序列如SEQ No.6所示;具体为:5’-AAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAACCAAATTCAAAAAAA-SH(CH3)6-3’;
所述的S链5’第12个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的AgMBs链5’第16个碱基后面连接有rA,为核糖核酸RNA腺嘌呤;所述的S链、AgMBs链的3’端连有inverted dT;所述的S1链的3’端连有SH(CH3)6。
2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)环形模板构建及银纳米簇的制备;
(2)对电极进行抛光预处理;
(3)将S1层修饰到电极表面;
(4)将RCA产物层修饰到电极表面。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)环形模板的构建方法如下:将灭菌水,5’磷酸化挂锁式探针Padlock DNA,连接探针和T4 DNA连接酶缓冲液混匀,
95 ℃变性,然后慢慢冷却至室温完成杂交,然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶,反应;之后灭活体系中的T4 DNA连接酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)银纳米簇的制备方法为:AgMBs核酸序列与pH=7.0磷酸缓冲溶液混合,然后加入AgNO3溶液,Ag+ : DNA=6 : 1,冷却,加入NaBH4还原,剧烈摇晃, 4 ℃黑暗中反应6 h。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)将S1层修饰到电极表面,包括以下步骤:将灭菌水,5×PBS缓冲液,三(2-羧乙基)膦TCEP,S1链到步骤(2)的电极表面,在37℃下孵育2 h,清洗。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)将RCA产物层修饰到电极表面的操作步骤如下:a.取10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,10×RCA buffer,环状模板和AgMBs,S,phi29 DNA聚合酶,dNTP,然后加入miRNA,最后加入超纯水混合,在37 ℃孵育4 h;
b.取a溶液滴加到预先修饰好的电极上,然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2 h,清洗。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述电极为金电极。
8.采用权利要求2所述的制备方法制备得到的电化学生物传感器,其特征在于,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为0到-1V,脉冲宽度0.05 V,扫描速率为
0.05 s,采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化,检测待测目标物。
9.采用权利要求2所述的制备方法制备的电化学生物传感器在非疾病诊断上检测miRNA的应用。