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专利号: 2020102176899
申请人: 江苏科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2026-01-15
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于筛选无外源DNA的基因编辑作物的病毒载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)对pTRV2载体骨架上1个BsaI酶切位点进行同义突变,得无BsaI酶切位功能的载体骨架;

(2)将特异性靶向sgRNA插入到所述无BsaI酶切位功能的载体骨架的多克隆位点EcoRI和BamH I之间,得载体pTRV2‑sgRNA;所述特异性靶向sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(3)将番茄PDS基因的靶标sg序列的引物对退火成PDS双链sg;所述引物对包括PDS‑sg‑F和PDS‑sg‑R,所述PDS‑sg‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述PDS‑sg‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述番茄PDS基因的靶标sg序列如SEQ ID NO.4所示;

(4)用BsaI酶将所述载体pTRV2‑sgRNA酶切后纯化;将PDS双链sg与酶切纯化后的载体用T4 DNA ligase 连接,转化大肠杆菌DH5а,得病毒载体pTRV2‑sgPDS。

2.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(1)所述同义突变为将GGTCTC突变为GGTCTG。

3.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,设计所述番茄PDS基因的靶标sg序列时,其PAM序列为GGG。

4.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(4)所述酶切的温度为37℃,酶切的时间为10 12h。

~

5.一种利用权利要求1 4任一项所述构建方法构建得到的病毒载体pTRV2‑sgPDS。

~

6.权利要求5所述病毒载体pTRV2‑sgPDS在获得Cas9‑free的基因编辑植株中的应用。

7.一种获得Cas9‑free的基因编辑植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:利用权利要求5所述病毒载体pTRV2‑sgPDS侵染发芽后的种子,经培养后,筛选叶片正常未变白的植株,得Cas9‑free的基因编辑植株。

8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,在得到所述Cas9‑free的基因编辑植株后,还包括提取DNA,通过PCR进行基因分型。