1.一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器,其特征在于,传感器的制备具体步骤如下:(1)Au电极:将裸金电极在抛光布上抛光,然后在水中超声2~8min处理,再用蒸馏水缓缓冲洗三次,获得Au电极;
其中所述抛光布为含粒径为0.05μm的Al2O3悬浮液;
(2)Electrode 1:
①将含巯基的发卡DNA探针H0滴到Au电极表面,组装过夜,蒸馏水缓缓冲洗;接着把电极浸泡在巯基己醇MCH水溶液中组装用来封闭金电极表面未组装的区域,以减少其他生物分子的非特异性吸附,蒸馏水缓缓冲洗;②配制2.5μL尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG反应体系,然后将该反应液修饰到步骤①所获得的电极上,28~40℃孵育10~60min,蒸馏水缓缓冲洗;③配制HCR反应液:0.1~2μL 10×Tris反应缓冲液、发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2;将上述反应液滴涂到步骤②所获得的电极上在28~40℃下反应0.2~1.5h,蒸馏水缓缓冲洗;④配制
2.5μL TdT反应液,滴涂至步骤③所获得的电极表面,在28~40℃下放置0.2~1.5h,蒸馏水缓缓冲洗电极;
其中,所述含巯基的发卡DNA探针H0用量为0.5~7.5μL,浓度为0.01~0.5μM;
所述含巯基的发卡DNA探针H0为茎端杂交区含有4个尿嘧啶碱基,在尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG的作用下,尿嘧啶碱基能被识别切除;
所述巯基己醇MCH水溶液浓度为0.1~2mM;
所述尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG反应体系构成如下:尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG反应缓冲液,0.01~0.5μM DNA1以及0~10U/mL尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG,28~40℃孵育0.2~1.5h;
所述发夹DNA探针H1用量为0.1~2μL,浓度为0.01~0.5μM;
所述发夹DNA探针H2用量为0.1~2μL,浓度为0.01~0.5μM;
所述TdT反应液构成如下:TdT缓冲液,dATP:0.1~1μL,1~20mM;dGTP:0.1~1.5μL,1~
20mM,TdT:0.1~2.5μL,1~20U/mL;
(3)Electrode 2:
2+
在Electrode 1表面滴加Pb ,室温下静置10~45min,蒸馏水缓缓冲洗;再滴加血红素,室温下孵育10~45min,蒸馏水缓缓冲洗;之后将3,3‑二氨基联苯胺和H2O2滴至电极表面,在
28~40℃下放置0.1~1h,用于EIS检测,即制备获得所述基于DNANANOTREE检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器;
2+
其中,所述Pb 用量为0.5~5μL,浓度为1~1000nM;
所述血红素用量为0.5~7.5μL,浓度为0.1~1.8μM;
所述3,3‑二氨基联苯胺用量为1~5μL,浓度为0.5~10mM;
所述H2O2用量为1~5μL,1~20mM。
2.根据权利要求1所述的电化学阻抗传感器,其特征在于,所述的10×Tris反应缓冲液由以下溶液配制:50mM三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、500mM氯化镁,pH 8.0。
3.根据权利要求1或2所述的基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器的应用,其特征在于,应用于尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG的活性检测。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,应用方法如下:在传感器制备过程中,加入不同浓度的尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG,检测所制备的传感器的电化学阻抗响应,在0.0001~
4U/mL之间,交流阻抗强度与UDG浓度的对数之间呈现良好的线性关系,检测限为0.00003U/mL。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,电化学参数条件如下:交流阻抗法,振幅:
5 ‑2 3‑/4‑
5mV,频率范围:10至10 Hz,溶液:0.1M KCl+5mM[Fe(CN)6] 。