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专利号: 2019110050404
申请人: 闽南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法,其特征在于,其包括如下步骤:

(1)构建转基因斑马鱼;

(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模;

在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中,先构建表达载体,再将所述表达载体与Tol2mRNA混合,显微注射到斑马鱼胚胎中;所述表达载体包括pdx1基因启动子,编码荧光蛋白的基因和nsfb基因;

其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。

2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述pdx1基因启动子序列如SEQ ID NO.6所示,所述nsfb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述nsfb基因编码的NTR蛋白序列如SEQ ID NO.8所示;所述编码荧光蛋白的基因为mCherry基因,编码橙色荧光蛋白的基因或编码黄色荧光蛋白的基因中的任意一种;

优选的,所述编码荧光蛋白的基因为mCherry基因,所述mCherry基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.7所示;所述mCherry基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述表达载体的构建方法包括如下步骤:先构建pSTEos-pdx1中间载体并扩增mCherry-NTR插入片段,再将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-NTR插入片段进行双酶切,回收后连接构建得到所述表达载体Tol2-pdx1-mCherry-NTR。

5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-NTR中间载体进行双酶切所采用的酶为XbaI和BamHI限制性内切酶。

6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述表达载体的构建方法还包括构建pSTEos-pdx1中间载体,所述构建pSTEos-pdx1中间载体包括如下步骤:以斑马鱼基因组为模板,采用第一引物和第二引物扩增pdx1启动子片段,再对扩增获得的pdx1启动子片段和pSTEos载体进行双酶切,酶切回收后,连接获得pSTEos-pdx1中间载体;

优选的,所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;

优选的,对扩增获得的pdx1启动子片段和pSTEos载体进行双酶切所采用的酶为BglII和BamHI限制性内切酶。

7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述药物为甲硝唑,所述甲硝唑的作用浓度为8-10mM;

优选的,所述甲硝唑的作用浓度为8mM。

8.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述斑马鱼胚胎的发育期为72hpf时期,每个所述斑马鱼胚胎的注射量为1-2nL。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的构建方法得到的Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型在筛选治疗Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述筛选治疗Ⅱ型糖尿病的药物的方法包括以下步骤:若施用药物后,Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型红色荧光增强,血糖浓度降低,胰岛素浓度升高,则判断该药物具有治疗Ⅱ型糖尿病的功效;

若施用药物后,Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型红色荧光保持不变,血糖浓度和胰岛素浓度无明显变化,则判断该药物不具有治疗Ⅱ型糖尿病的功效。