1.一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)DNA链的高温退火处理
取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5,向每个PV管中加入190µL浓度为20mM pH=
7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液,所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mM MgCl2;
接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1,所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGA GTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’;
再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2,所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TAC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3’;
向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1,所述探针H1中包含有G-四链体DNA酶功能结构,探针H1的碱基序列为5’- GC CCT ACC CAA GCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’,其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸,其余均为脱氧核糖核酸;
向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2,所述探针H2中包含有G-四链体DNA酶功能结构,探针H2的碱基序列为5’- TTT GGG TAG GGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAA A-3’,其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸,其余均为脱氧核糖核酸;
向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA溶液,所述连接DNA溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’;
将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃,保持5min后迅速降温至室温,分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用;再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃,保持5min后缓慢降温2h至室温,分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用;
(2)均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量
取6个PV管,向每个PV管中均加入经步骤(1)高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2,再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl,于37℃涡旋混匀反应120min;再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液,该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO,于37℃涡旋混匀反应50min;接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl,显色反应5min之后,利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值,以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系;
(3)样品中血小板衍生生长因子BB含量的检测
取处理后的样品溶液10µL,向其中加入经步骤(1)高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、
10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2,于37℃涡旋混匀反应120min;再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液,该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO,于37℃涡旋混匀反应50min;接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl,显色反应5min之后,利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值,根据步骤(2)中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系,计算出样品溶液中血小板衍生生长因子的含量。
2.如权利要求1所述的一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法在检测样品中血小板衍生生长因子BB中的应用。