1.一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法,其特征在于:包括以下步骤:采用感染晚疫病菌的烟草叶片,通过①查找马铃薯StRab5b的基因序列,设计克隆和构建载体所用的引物,对马铃薯的StRab5b基因进行克隆;对马铃薯的StRab5b基因克隆后,用载体pCAMBIA1300‑221,构建出表达载体PCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP;
②采用步骤①构建出的表达载体
PCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP注入烟草叶片中,观察表达载体PCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP在烟草叶片中的瞬时表达,以评估上述表达载体抗烟草晚疫病的抗菌情况;
所述步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆,构建出表达载体PCAMBIA1300‑
221‑StRab5b‑GFP的方法包括以下步骤:a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后,利用高保真酶 HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因,回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段;将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体Simple Cloning Vector连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作,涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒,保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用;
b、利用BglII和KpnI双酶切PLG‑Rop重组质粒后获得PLG片段,BglII和KpnI双酶切的步骤a中StRab5b基因片段与平末端载体 Simple Cloning Vector连接的重组质粒后获得StRab5b片段,PLG片段与StRab5b片段连接后形成PLG‑StRab5b片段后转入大肠杆菌;
c、利用XbaI和SacI双酶切的步骤b获得的PLG‑StRab5b重组质粒后获得GFP‑StRab5b片段并回收,XbaI和SacI双酶切pCAMBIA1300‑221载体后获得载体大片段,GFP‑StRab5b片段与载体大片段连接后获得pCAMBIA1300‑221‑GFP‑StRab5b重组质粒后转入大肠杆菌,挑取阳性菌落后提取质粒,酶切鉴定后转入农杆菌GV3101中保存;
所述马铃薯StRab5b基因如下:
步骤②所述的表达载体pCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP注入烟草叶片中的方法包括以下步骤:I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP、pCAMBIA 1300‑221‑GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中,振荡培养过夜;
II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后,在转速8000rpm的条件下离心
2min,收集菌体;
III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液,测定菌液的OD600值为0.5‑0.6时备用;
IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液,并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧,在21℃温度下培养24h;
V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌,左侧接种H2O;
VI、然后将接种后的叶片置于21℃,80%湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法,其特征在于:步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是:通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA,用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA,用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物;所述的用Primer5.0软件设计的引物为:Rab5b‑F:5′‑GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC‑3′,Rab5b‑R:5′‑GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG‑3′。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法,其特征在于:YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮,在温度28℃,转速200rpm的条件下振荡培养过夜。