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专利号: 2021116403996
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo,其特征在于,所述侵染性克隆表达载体pCaYo是由油菜花叶病毒YOMV全长序列置于双35S启动子下游制备得到;所述油菜花叶病毒YOMV的基因组全长序列如SEQ ID NO.11所示。

2.携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP,其特征在于,所述侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP是由YoMV CP基因启动子转录GFP,用TMV‑GFPCP基因和3’UTR替换YoMV CP和3’UTR所制备得到;所述侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。

3.如据权利要求1所述的一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的构建方法,其特征在于,包含以下步骤:

S1:利用RT‑PCR技术获得油菜花叶病毒cDNA全长序列;

S2:采用限制性内切酶StuI和BamHI酶切双元表达载体pCass4‑RZ,获得pCass4‑RZ线性化载体;

S3:采用无缝克隆技术将步骤S1获得的YoMV全长序列与步骤S2获得的线性化载体pCass4‑RZ连接,产物命名为pCaYo;

S4:将步骤S3获得的连接产物pCaYo转化至大肠杆菌DH5α中,筛选并提取获得含油菜花叶病毒全长的侵染性克隆载体pCaYo。

4.如据权利要求2所述的一种携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的构建方法,其特征在于,包含以下步骤:T1:分别获得油菜花叶病毒cDNA全长、GFP、TMV‑GFPCP和3’UTR;

T2:采用限制性内切酶StuI和BamHI酶切双元表达载体pCaY‑RZ,获得pCaY‑RZ线性化载体;

T3:将步骤T1获得的YoMV全长序列、GFP基因、TMV‑GFPCP和3’UTR与步骤T2获得的线性化载体pCaY‑RZ采用酵母同源重组技术连接,将其转化至酵母菌YPH501中,产物命名为YoMV‑GFP;

T4:将步骤T3培养的含YoMV‑GFP的酵母菌株,筛选并提取获得含油菜花叶病毒全长的侵染性克隆载体YoMV‑GFP。

5.一种pCaYo重组载体的农杆菌菌株,其特征在于,由权利要求1所述的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo转化到农杆菌中获得。

6.一种携带YoMV‑GFP重组载体的农杆菌菌株,其特征在于,由权利要求2所述的携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP转化到农杆菌中获得。

7.如权利要求1所述的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的验证方法,其特征在于,通过农杆菌冻融法将权利要求1的pCaYo载体转化农杆菌GV3101中,通过农杆菌注射接种到本氏烟的真叶中,观察本氏烟的发病症状,证实含油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo在本氏烟上具有系统侵染性的载体。

8.如权利要求2所述的携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的验证方法,其特征在于,通过冻融法将权利要求2所述的YoMV‑GFP载体导入农杆菌GV3101中,并通过农杆菌注射接种到本氏烟的真叶中,观察本氏烟的发病症状,证实含携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP在本氏烟上具有系统侵染性载体。

9.根据权利要求3所述的一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的构建方法,其特征在于,步骤S1中将YoMV全长分两段获取全长cDNA,所用引物如SEQ ID NO:1~4所示的pCaYo‑StuI‑1F、pCaYo‑2R、pCaYo‑2F、pCaYo‑BamHI‑3R。

10.根据权利要求4所述的一种携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的构建方法,其特征在于,在T1步骤中,油菜花叶病毒cDNA全长的获得是以侵染性克隆载体pCaYo质粒为模板分两段扩增得到,所用引物如SEQ ID NO:5~8所示的YoMV GFP‑

1F、YoMV GFP‑1R、YoMV GFP‑2F、YoMV GFP‑2R;GFP和TMV 3’UTR所用引物如SEQ ID NO:9、10所示的YoMV GFP‑3F、YoMV GFP‑3R。