1.一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo,其特征在于,所述侵染性克隆表达载体pCaYo是由油菜花叶病毒YOMV全长序列置于双35S启动子下游制备得到;所述油菜花叶病毒YOMV的基因组全长序列如SEQ ID NO.11所示。
2.携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP,其特征在于,所述侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP是由YoMV CP基因启动子转录GFP,用TMV‑GFPCP基因和3’UTR替换YoMV CP和3’UTR所制备得到;所述侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。
3.如据权利要求1所述的一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的构建方法,其特征在于,包含以下步骤:
S1:利用RT‑PCR技术获得油菜花叶病毒cDNA全长序列;
S2:采用限制性内切酶StuI和BamHI酶切双元表达载体pCass4‑RZ,获得pCass4‑RZ线性化载体;
S3:采用无缝克隆技术将步骤S1获得的YoMV全长序列与步骤S2获得的线性化载体pCass4‑RZ连接,产物命名为pCaYo;
S4:将步骤S3获得的连接产物pCaYo转化至大肠杆菌DH5α中,筛选并提取获得含油菜花叶病毒全长的侵染性克隆载体pCaYo。
4.如据权利要求2所述的一种携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的构建方法,其特征在于,包含以下步骤:T1:分别获得油菜花叶病毒cDNA全长、GFP、TMV‑GFPCP和3’UTR;
T2:采用限制性内切酶StuI和BamHI酶切双元表达载体pCaY‑RZ,获得pCaY‑RZ线性化载体;
T3:将步骤T1获得的YoMV全长序列、GFP基因、TMV‑GFPCP和3’UTR与步骤T2获得的线性化载体pCaY‑RZ采用酵母同源重组技术连接,将其转化至酵母菌YPH501中,产物命名为YoMV‑GFP;
T4:将步骤T3培养的含YoMV‑GFP的酵母菌株,筛选并提取获得含油菜花叶病毒全长的侵染性克隆载体YoMV‑GFP。
5.一种pCaYo重组载体的农杆菌菌株,其特征在于,由权利要求1所述的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo转化到农杆菌中获得。
6.一种携带YoMV‑GFP重组载体的农杆菌菌株,其特征在于,由权利要求2所述的携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP转化到农杆菌中获得。
7.如权利要求1所述的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的验证方法,其特征在于,通过农杆菌冻融法将权利要求1的pCaYo载体转化农杆菌GV3101中,通过农杆菌注射接种到本氏烟的真叶中,观察本氏烟的发病症状,证实含油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo在本氏烟上具有系统侵染性的载体。
8.如权利要求2所述的携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的验证方法,其特征在于,通过冻融法将权利要求2所述的YoMV‑GFP载体导入农杆菌GV3101中,并通过农杆菌注射接种到本氏烟的真叶中,观察本氏烟的发病症状,证实含携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP在本氏烟上具有系统侵染性载体。
9.根据权利要求3所述的一种油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体pCaYo的构建方法,其特征在于,步骤S1中将YoMV全长分两段获取全长cDNA,所用引物如SEQ ID NO:1~4所示的pCaYo‑StuI‑1F、pCaYo‑2R、pCaYo‑2F、pCaYo‑BamHI‑3R。
10.根据权利要求4所述的一种携带GFP基因的油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体YoMV‑GFP的构建方法,其特征在于,在T1步骤中,油菜花叶病毒cDNA全长的获得是以侵染性克隆载体pCaYo质粒为模板分两段扩增得到,所用引物如SEQ ID NO:5~8所示的YoMV GFP‑
1F、YoMV GFP‑1R、YoMV GFP‑2F、YoMV GFP‑2R;GFP和TMV 3’UTR所用引物如SEQ ID NO:9、10所示的YoMV GFP‑3F、YoMV GFP‑3R。