1.一种提高蚕丝产量和优化家蚕品种的非编码RNA敲除品系,其特征在于,所述提高蚕丝产量和优化家蚕品种的非编辑RNA为let-7microRNA,其在家蚕中部丝腺和后部丝腺中的敲除品系分别为[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG],用于敲除用的let-7-2gRNA的DNA序列为SEQ ID NO.1。
2.一种如权利要求1所述提高蚕丝产量和优化家蚕品种的sgRNA载体、let-7sgRNA表达品系筛选及基因敲除品系筛选方法,其特征在于,所述提高蚕丝产量和优化家蚕品种的sgRNA载体及基因敲除品系筛选方法包括:步骤一:构建let-7的sgRNA转基因表达载体;
步骤二:let-7的sgRNA表达品系筛选;
步骤三:let-7敲除品系Δlet-7-PSG和Δlet-7-MSG筛选;
步骤四:敲除形式鉴定:在pre-let-7上下游设计引物,扩增pre-let-7序列,通过测序,鉴定家蚕丝腺细胞基因组DNA上let-7位点的序列变化;
步骤五:let-7敲除后,对丝腺的异常表型进行分析。
3.如权利要求2所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因敲除品系筛选方法,其特征在于,所述步骤一中,构建sgRNA转基因表达载体具体步骤包括:(1)CCtop在线预测网站中输入let-7次级前体序列SEQ ID NO:2,以G(N20)GG的结构找寻序列中的gRNA spacer SEQ ID NO:5~8;在gRNA spacer的5’-末端加入相应的碱基,let-7sgRNA的引物SEQ ID NO:5~8;
(2)让引物退火形成双链:95℃变性5min,95℃梯度降温到25℃,每秒下降0.1℃,共700个循环;
(3)配制体系,37℃酶切过夜后回收pUC57[U6-2gRNA]载体骨架序列SEQ ID NO:9;
(4)将sgRNA1-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-2gRNA]载体骨架上,构建成pUC57[U6-sgRNA1]质粒;
(5)配制体系,37℃酶切4h后,回收pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架;
(6)将sgRNA2-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架上,构建成pUC57[U6,let-7-2gRNA]质粒;
(7)配制体系,37℃酶切4h后,回收[U6,let-7-2gRNA]片段;
(8)将回收的let-7敲除双gRNA的表达片段[U6,let-7-2gRNA]连接到piggyBac[3xP3-EGFP]载体上,构建成let-7敲除双gRNA转基因表达载体:pBac[3xp3-EGFP,let-7-2gRNA]。
4.如权利要求1所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因筛选方法,其特征在于,所述步骤二中,sgRNA表达品系筛选具体步骤包括:(1)提取pBac[3xp3-EGFP,let-7-2gRNA]超纯质粒,与表达piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG超纯质粒按摩尔比1:1混合;将混合后的质粒注射到D9L蚕卵中,然后用无毒瞬干胶封闭注射孔;
(2)将注射后的蚕卵放入25℃,相对湿度90%的生化培养箱进行催青,9-10天后,用新鲜桑叶对家蚕幼虫进行饲养,为G0代幼虫;
(3)将G0代幼虫饲养至成虫并自交,获得G1代产卵,催青至第6天,进行转基因阳性个体筛选;G1代中胚胎的阳性个体为[let-7-2gRNA];
(4)G1代饲养至成虫,对成虫复眼再次进行荧光筛选,筛选到的阳性个体用于后续的杂交实验。
5.如权利要求1所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因筛选方法,其特征在于,所述步骤三中,let-7敲除品系[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG]筛选具体步骤包括:(1)将[let-7-2gRNA]品系分别与中部丝腺Cas9表达品系[Cas9-MSG]和后部丝腺Cas9表达品系[Cas9-PSG]进行杂交;
(2)杂交得到的F1代蚕卵放入25℃、相对湿度90%的生化培养箱进行催青,催青至5~6天时,进行报告基因筛选;F1代胚胎中得到let-7中部丝腺敲除个体[Δlet-7-MSG]和let-7后部丝腺敲除个体[Δlet-7-PSG]。
6.如权利要求1所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因筛选方法,其特征在于,所述步骤四中,敲除形式鉴定具体步骤包括:(1)将筛选到的[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄,解剖获得丝腺材料;
(2)利用组织DNA提取试剂盒,提取丝腺细胞总DNA;
(3)设计引物对靶位点序列进行扩增,并连接到pMD-19-T simple载体上进行测序;引物包括:>let-7KO-F:CGTCATCAAGGATCCAGCAGT;
>let-7KO-R:TTAGTGGTCTTGTGAGGAATGTT;
(4)用BioEidt软件对序列进行比对分析,鉴定碱基缺失数目。
7.如权利要求1所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因筛选方法,其特征在于,所述步骤五中,let-7敲除后,对丝腺表型进行分析具体步骤包括:(1)将筛选到的[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄第6天;
(2)解剖丝腺,观察表型并拍照。
8.如权利要求1所述的提高蚕丝产量和优化家蚕品种的基因筛选方法,其特征在于,步骤五后,还需进行:对丝腺长度、重量和茧重进行统计分析,具体步骤包括:(1)将筛选到的[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄第6天;
(2)解剖后部丝腺对长度、重量进行测量;
(3)继续将筛选到的[Δlet-7-MSG]和[Δlet-7-PSG]幼虫饲养至吐丝结茧;幼虫化蛹,结束吐丝后对蚕茧重量进行称重和比较。