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专利号: 202210213352X
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-06
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,其通过GAL4/UAS系统,构建了若干个分别在家蚕MSG和PSG中特异启动表达的GAL4表达载体,通过将密码子优化的Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游,最终构建成UAS表达载体,进而利用GAL4/UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑。

2.依据权利要求1所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,所述若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体为4个在家蚕MSG中特异启动表达。

3.依据权利要求2所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,所述多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体为3个在家蚕PSG中特异启动表达。

4.依据权利要求3所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,所述可控编辑方法利用GAL4/UAS双元表达系统和CRISPR/Cas9的基因编辑系统,用于产生一种能在家蚕中部丝腺和后部丝腺中进行组织特异性敲除的转基因表达载体。

5.依据权利要求4所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,其包括以下步骤:步骤S1,家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建;

步骤S2,针对家蚕MSG的UAS敲除表达载体的构建;

步骤S3,家蚕PSG特异GAL4表达载体的构建;

步骤S4,针对家蚕PSG的UAS敲除表达载体的构建;

步骤S5,转基因家蚕的制作;

步骤S6,形态学观察及分子检测。

6.依据权利要求5所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建步骤包括分别构建了4种家蚕中部丝腺特异表达载体,所述表达载体目的基因表达框包括:启动子即4种家蚕中部丝腺特异的启动子:家蚕Ser1基因启动子(SEQ ID NO.1)[NCBI基因ID:AB007831.1]、家蚕Ser2基因启动子(SEQ ID NO.2)[NCBI基因ID:AB193317.1]、家蚕Ser3基因启动子(SEQ ID NO.3)[NCBI基因ID:AB299446.1]、家蚕Ser4基因启动子(SEQ ID NO.4)[NCBI基因ID:XM_038013949.1]。

7.依据权利要求6所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD(SEQ ID NO.5);VP16为特异激活基因表达的蛋白结构域(SEQ ID NO.6);Ser1‑polyA为终止信号(SEQ ID NO.7),将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3‑DsRed]。

8.依据权利要求7所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法,其特征在于,pBac[3×P3‑DsRed]载体骨架由以下步骤完成:首先组装3×P3‑DsRed序列(SEQ ID NO.8),该3×P3‑DsRed序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了DsRed(红色荧光蛋白)序列组成;随后在3×P3‑DsRed序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。