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专利号: 2019105928211
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-01
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种MC1R基因单倍型的鉴定方法,其特征在于,所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括:步骤一,通过对MC1R基因进行PCR扩增后,采用单端Sanger测序获得变异序列;具体为:采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体,对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序,比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点,挑选出4个SNPs位点、所述4个SNPs位点为c .69C>T  ,c  .212T>C ,c  .274G>A  ,c .644A>C,利用PHASE软件构建出三种单倍型,其中单倍型 H1对单倍型H2和单倍型H3表现为完全显性,所述单倍型 H1为TCAA、所述单倍型H2为TCAC、所述单倍型H3为CTGA;H1控制黑羽性状,在黑羽个体中,H1H1为纯合黑羽个体,而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体;

步骤二,基于构建的单倍型,对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析,鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。

2.如权利要求1所述的 MC1R基因单倍型的鉴定方法,其特征在于,所述步骤一通过对MC1R基因进行PCR扩增后,采用单端Sanger测序获得变异序列具体包括:通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物,将酚‑氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板,制备20μL PCR反应体系,并按照反应程序实施PCR;用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,将符合要求的PCR产物进行sanger测序;根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。

3.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法,其特征在于,所述步骤二的基于构建的单倍型,对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析,鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型具体包括:通过测交获得待测个体的表型与基因型;利用黑羽个体与非黑羽个体交配,根据后代出现黑羽与非黑羽的情况,判定待测个体的基因型;随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析,基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析,最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型,确定黑羽纯合基因型。

4.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法,其特征在于,所述通过对MC1R基因进行PCR扩增的方法为:(1)、获取鸡血液或组织样本,进行DNA提取;

鸡血5μL或组织30mg样本的基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒DP304提取或采用传统的酚‑氯仿法提取基因组DNA;

(2)、根据鸡MC1R基因设计引物进行PCR扩增,并进行琼脂糖凝胶电泳,PCR产物片段大小为1144bp;

PCR扩增正向引物为5’‑ATCCTTGTGCCTGGGGTG‑3’,反向引物为5’‑CATCCATCCATCCTCCTGTC‑3’,其退火温度60℃,延伸时间1min,引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度;

PCR反应体系为20μl:10μl 2xTaq PCR Master Mix,6.4μl ddH 2 O,上下游引物各0.8μl,DNA模板2μl;

反应程序:95℃变性3min,95℃变性45s,60℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min;

电泳条件:2.5%EB电泳缓冲液中在180V的电压条件下电泳20min;

(3)、将电泳检测后符合目的片段大小的PCR产物送公司采用Sanger测序,测序引物序列为:5’‑TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG‑3’;Sanger测序方法参照测序公司要求进行;

(4)将Sanger测序所获得DNA序列利用SeqMan软件结合人工进行SNPs位点识别并判定每个SNPs位点的基因型;

(5)利用PHASE软件对上述4个SNPs位点构建单倍型,4个SNPs位点构建成三种单倍型,其中单倍型H1对H2和H3表现为完全显性,H1控制黑羽性状;

(6)结合已知基因型的黑羽个体和非黑羽个体信息,判定在黑羽个体中,H1H1为纯合黑羽个体,而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体,实现对黑羽个体中纯合个体和杂合个体的准确区分。

5.一种利用权利要求1所述MC1R基因单倍型的鉴定方法在黑羽鸡育种群体基因型鉴定中的应用。