1.水稻抗病基因OsSeh1的功能鉴定方法,其特点在于,按照以下步骤具体实施:
步骤一、过表达载体与RNAi载体构建及转化
测序正确的OsSeh1基因全长,以p1301a载体为骨架,构建过表达载体OsSeh1-p1301a,干涉片段与pUCCRNAi载体用BamHI/BglII、SalI/XhoI两对同尾酶进行酶切,T4连接酶连接,构建双向插入片段的干涉重组质粒2Seh1-pUCC,用PstI单酶切验证,验证正确的2Seh1-pUCC质粒与p1301a载体用SalI、PstI双酶切,T4连接酶连接,构建干涉融合表达载体2Seh1-pUCC-p1301a,构建好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11,通过GUS染液对转基因植株根和叶进行染色,显蓝色的为阳性植株,过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因,设计引物hyF5′-ACTCACCGCGACGTCTGT-3′,hyR5′-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3′对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增,能扩增出1009bp大小片段为阳性植株;
步骤二、亚细胞定位载体构建、转化及观察
设计引物sF5′-AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3′,sR5′-TACCCGGGGTGAGACACATTGCAGTC-3′,将OsSeh1CDS序列的终止子切除,两端分别加上SpeI和SmaI酶切位点测序正确后,连接到p1305.1-GFP载体,酶切验证正确,电转法导入农杆菌EH105得到转化子,将转化子注射到烟草中,以注射携带空载体1305.1-GFP的EH105菌株作为阴性对照,注射后的烟草进行暗培养,36h后,在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm2大小烟草叶片,制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位;
步骤三、OsSeh1水杨酸诱导表达分析
生长到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水杨酸叶面喷洒处理,分别在处理后的0、12、24、36、48和72h取样,Trizol法提取总RNA,反转录成cDNA,对OsSeh1基因进行荧光定量PCR试验,观察水杨酸处理后该基因在不同时间段的表达水平,实验采用水稻Actin作为内参基因,每个样本重复测量3次,结果以2-△△CT值表示基因表达的相对值,以3个样本测定结果的平均值作为最终结果,荧光定量PCR的Seh1和Actin引物分别如下:Seh1F5′-CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3′,Seh1R5′-GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3′;ActinF5′-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3′,ActinR5′-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3′;
步骤四、OsSeh1转基因植株体内水杨酸含量测定及抗病性鉴定
利用高效液相色谱,对转基因植株以及对照植株叶片中自由态水杨酸含量进行测定;
根据峰面积所占的比例,分别计算出对照与过表达植株T1-1/2/3以及RNAi植株体内游离态SA的含量,每组实验重复3次,采用牙签嵌入接种法对过表达植株、干涉植株、对照中花11野生型植株分别进行纹枯病病原菌接种,重复2次,每次各接种15株,利用加湿器和温室,控制温度在35℃左右及湿度90%以上的条件下生长,15天后对水稻病菌侵染症状进行观察统计,按病斑面积占叶鞘总面积的比例来判定植株的感病情况;
所述基因OsSeh1的核糖核酸分子序列信息为:
ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGCAGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
2.根据权利要求1所述的水稻抗病基因OsSeh1功能鉴定方法,其特点在于:步骤四的游离态SA的含量的计算,实验数据均用SPSS统计软件处理和统计分析,方法为单因素方差分析,P<0.05为差异显著,p>0.05为差异不显著。
3.水稻抗病基因OsSeh1的应用,其特点在于,其应用于水稻纹枯病的防治,基因OsSeh1的核糖核酸分子序列信息为:
ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGCAGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。