1.一种转氨酶‑辅酶磷酸吡哆醛共固定化基因工程菌细胞,其特征在于所述共固定化基因工程菌细胞按如下方法制备:将转氨酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH
9.0、100 mM甘氨酸缓冲液悬浮,获得菌悬液;向菌悬液中加入辅酶PLP,在20‑30℃,500 rpm条件下水浴搅拌30 min;再向菌悬液中加入活性炭,在20‑30℃,500 rpm条件下水浴搅拌30 min;然后加入质量浓度5%聚乙烯亚胺水溶液,在20‑30 ℃,500 rpm条件下水浴搅拌交联1 h ;最后加入质量浓度50%戊二醛水溶液,在20‑30 ℃,500 rpm条件下水浴搅拌交联1 h,抽滤,滤饼用pH 9.0、100 mM甘氨酸缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即获得转氨酶‑PLP共固定化细胞;所述菌悬液中湿菌体含量为50 g/L;所述辅酶PLP加入量为0.1‑2 g/L,活性炭加入量以菌悬液体积计为5‑20 g/L;所述聚乙烯亚胺水溶液体积用量以菌悬液体积计为2‑
6%;所述戊二醛水溶液体积用量以菌悬液体积计为0.4‑2%;所述转氨酶基因工程菌是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入大肠杆菌获得;所述活性炭为颗粒活性炭,在加入前先进行预处理,所述预处理方法为:将活性炭过40目筛,再加入1 M盐酸中,50℃搅拌1 h,抽滤,用蒸馏水清洗滤液至中性,滤饼烘干,即为预处理后的活性炭。
2.如权利要求1所述转氨酶‑PLP共固定化基因工程菌细胞,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37 ℃,200 rpm下培养8 h,再以体积浓度10%接种量接种至新鲜的含有终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中,于37 ℃,500 rpm下培养至菌体OD600达6~8,加入终浓度为0.1 mM的IPTG,28 ℃下诱导培养11 h,发酵液4 ℃、8000 rpm离心10 min,弃去上清液,收集沉淀,即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。
3.权利要求1所述转氨酶‑PLP共固定化基因工程菌细胞在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。
4.一种利用权利要求1所述转氨酶‑PLP共固定化基因工程菌细胞不对称还原制备西他列汀中间体中的方法,其特征在于所述方法包括:(1)将转氨酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 9.0、100 mM甘氨酸缓冲液悬浮,获得菌悬液;向菌悬液中加入辅酶PLP,在20‑30℃,500 rpm条件下水浴搅拌30 min;再向菌悬液中加入活性炭,在20‑30℃,500 rpm条件下水浴搅拌30 min;然后加入质量浓度5%聚乙烯亚胺水溶液,在20‑30 ℃,500 rpm条件下水浴搅拌交联1 h ;最后加入质量浓度50%戊二醛水溶液,在20‑30 ℃,500 rpm条件下水浴搅拌交联1 h,抽滤,滤饼用pH 9.0、100 mM甘氨酸缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,获得转氨酶‑PLP共固定化细胞;
(2)以转氨酶‑PLP共固定化基因工程菌细胞为催化剂,以(3R)‑3‑酮基‑1‑[3‑(三氟甲基)‑5,6,7,8‑四氢‑1,2,4‑三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑基]‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮为底物,以二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂,于pH 8.0‑10.0的缓冲液,以异丙胺为反应氨基供体,在
20‑40 ℃、400‑700 rpm条件下反应12‑36 h,于反应液中获得西他列汀中间体——(3R)‑3‑氨基‑1‑[3‑(三氟甲基)‑5,6,7,8‑四氢‑1,2,4‑三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑基]‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于所述催化剂用量为 20‑200 g/L反应体系,DMSO体积用量以反应体系总体积计为30‑70%,底物终浓度25‑150 g/L,异丙胺添加量为
0.5‑3 mM。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于转氨酶‑PLP共固定化细胞催化合成西他列汀后,获得底物、产物和共固定化细胞的混合液;将混合液抽滤得到滤饼a和滤液a,再用乙酸乙酯清洗滤饼a得到滤饼b和滤液b,最后用蒸馏水清洗滤饼b得到滤饼c和滤液c;
用浓盐酸将滤液c pH调至1.5,与滤液b混合搅拌20 min,得到有机相a和水相a;用0.1 M的盐酸再次反萃取滤液b,混合搅拌20 min, 得到有机相b和水相b;合并滤液a、水相a和水相b,用浓盐酸将反应液pH调至1.5,用二氯甲烷萃取一次,获得有机相c和水相c;水相c用氢氧化钠调节pH至12,再用二氯甲烷萃取,获得有机相d和水相d,水相d中再加入二氯甲烷萃取,获得有机相e和水相e,合并有机相d和有机相e并用饱和氯化钠水洗二次,加入无水硫酸钠干燥,抽滤去除硫酸钠,45 ℃下旋转蒸发,得到西他列汀手性中间体。