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专利号: 2019100757372
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种转氨酶‑PLP共固定化酶,其特征在于所述共固定化 酶由按下方法制备获得:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37℃、200rpm下培养8h,再以体积浓度

10%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中,于37℃、

500rpm下培养至菌体OD600达6~8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养11h,发酵液

4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集沉淀,获得湿菌体悬浮于的pH7.0~9.0缓冲液中得到50~150g/L的菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到转氨酶粗酶液;所述pH 7.0~9.0缓冲液为Tris‑HCl、甘氨酸‑NaOH、PB、Na2CO3‑NaHCO3或三乙醇胺‑HCl缓冲液;

(2)环氧树脂LX‑1000HFA用蒸馏水浸泡12~18h,抽滤取滤饼,得到预处理后的环氧树脂备用;

(3)粗酶液中加入0.1~8mM的辅酶磷酸吡哆醛,加入步骤(2)预处理后的环氧树脂,环氧树脂添加量为20~30mg/100mL粗酶液;

(4)在15~45℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~48h,抽滤,滤饼用pH 7.0~

9.0缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述转氨酶‑PLP共固定化酶。

2.权利要求1所述转氨酶‑PLP共固定化酶的制备方法,所述方法包括:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌经发酵培养,获得湿菌体悬浮于的pH 7.0~9.0缓冲液中得到菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到转氨酶粗酶液;

(2)环氧树脂LX‑1000HFA用蒸馏水浸泡12~18h,抽滤取滤饼,得到预处理后的环氧树脂备用;

(3)粗酶液中加入0.1~8mM的辅酶磷酸吡哆醛,加入步骤(2)预处理后的环氧树脂,环氧树脂添加量为20~30mg/100mL粗酶液;

(4)在15~45℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~48h,抽滤,滤饼用pH 7.0~

9.0缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述转氨酶‑PLP共固定化酶。

3.权利要求1所述的转氨酶‑PLP共固定化酶在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用为:以转氨酶‑PLP共固定化酶为催化剂,以(3R)‑3‑酮基‑1‑[3‑(三氟甲基)‑5,6,7,8‑四氢‑1,2,4‑三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑基]‑

4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮为底物,以二甲基亚砜、N,N‑二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇或四氢呋喃为助溶剂,于pH 9.0、100mM三乙醇胺缓冲液中,以丙氨酸、异丙胺、二乙胺、氨水、甘氨酸、谷氨酸或三乙胺氨基为氨基供体,在20~50℃、400~700rpm条件下反应

12~36h,制得西他列汀中间体(3R)‑3‑氨基‑1‑[3‑(三氟甲基)‑5,6,7,8‑四氢‑1,2,4‑三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑基]‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:助溶剂体积用量为20~80%。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述转氨酶‑PLP共固定化酶用量为50~

300g/L反应体系,底物终浓度为25~150g/L,氨基供体摩尔浓度为底物的2~16倍。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述助溶剂为二甲基亚砜、体积用量为50%,所述氨基供体为异丙胺、摩尔浓度为底物的8倍。