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专利号: 2019100757372
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-25
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种转氨酶-PLP共固定化酶,其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌经发酵培养,获得湿菌体悬浮于的pH 7.0~9.0缓冲液中得到菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到转氨酶粗酶液;

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12~18h,抽滤取滤饼,得到预处理后的环氧树脂备用;

(3)粗酶液中加入0.1~8mM的辅酶磷酸吡哆醛,加入步骤(2)预处理后的环氧树脂,环氧树脂添加量为20~30mg/100mL粗酶液;

(4)在15~45℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~48h,抽滤,滤饼用pH 7.0~

9.0缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

2.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶,其特征在于所述pH 7.0~9.0缓冲液为Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na2CO3-NaHCO3或三乙醇胺-HCl缓冲液。

3.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶,其特征在于步骤(1)菌悬液浓度为50~

150g/L。

4.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶,其特征在于步骤(1)湿菌体按如下方法制得:将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37℃、200rpm下培养8h,再以体积浓度10%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中,于37℃、500rpm下培养至菌体OD600达6~8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养11h,发酵液4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集沉淀,即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。

5.权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化酶的制备方法,所述方法包括:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌经发酵培养,获得湿菌体悬浮于的pH 7.0~9.0缓冲液中得到菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到转氨酶粗酶液;

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12~18h,抽滤取滤饼,得到预处理后的环氧树脂备用;

(3)粗酶液中加入0.1~8mM的辅酶磷酸吡哆醛,加入步骤(2)预处理后的环氧树脂,环氧树脂添加量为20~30mg/100mL粗酶液;

(4)在15~45℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~48h,抽滤,滤饼用pH 7.0~

9.0缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

6.权利要求1~4之一所述的转氨酶-PLP共固定化酶在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述应用为:以转氨酶-PLP共固定化酶为催化剂,以(3R)-3-酮基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-

4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮为底物,以二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇或四氢呋喃为助溶剂,于pH 9.0、100mM三乙醇胺缓冲液中,以丙氨酸、异丙胺、二乙胺、氨水、甘氨酸、谷氨酸或三乙胺氨基为氨基供体,在20~50℃、400~700rpm条件下反应

12~36h,制得西他列汀中间体(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于:助溶剂体积用量为20~80%。

9.如权利要求7所述的应用,其特征在于:所述转氨酶-PLP共固定化酶用量为50~

300g/L反应体系,底物终浓度为25~150g/L,氨基供体摩尔浓度为底物的2~16倍。

10.如权利要求7所述的应用,其特征在于:所述助溶剂为二甲基亚砜、体积用量为

50%,所述氨基供体为异丙胺、摩尔浓度为底物的8倍。