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专利号: 2021116466637
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种草铵膦脱氢酶突变体,其特征在于,所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一:(1)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、或者第348位丝氨酸突变为丙氨酸;

(2)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为苯丙氨酸且第70位赖氨酸突变为丙氨酸;(3)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为谷氨酰胺且第78位天冬酰胺突变为丝氨酸;(4)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为酪氨酸、第348位丝氨酸突变为丙氨酸,第292位丙氨酸突变为半胱氨酸且第202位丙氨酸突变为亮氨酸。

2.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体编码基因。

3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组基因工程菌。

4.如权利要求3所述的重组基因工程菌,其特征在于,所述重组基因工程菌按如下步骤构建:将草铵膦脱氢酶突变体基因克隆到质粒pETDuet的MCS1的NcoI上,构建重组表达载体,保留质粒本身的His‑Tag基因;再将甲酸脱氢酶基因构建至重组表达载体的MCS2的NdeI上,获得共表达载体,转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),获得草铵膦脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶共表达的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在催化2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)‑丁酸制备L‑草铵膦中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的应用方法为:以含草铵膦脱氢酶突变体基因与甲酸脱氢酶基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体制备的固定化细胞为催化剂,以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)‑丁酸为底物,以甲酸铵为辅酶再生底+物,外源添加NAD,以pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系,在20‑50℃、

200‑800转/分钟进行转化反应,反应结束后,反应液抽滤,滤饼回收催化剂,滤液分离纯化,获得L‑草铵膦。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述固定化细胞按如下方法制备:将所述重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入pH6.0‑8.0的磷酸缓冲液中,加入载体,充分搅拌20~30min,再加入聚乙烯亚胺,充分搅拌20~30min,然后加入交联剂,充分搅拌20~

30min,减压抽滤,滤饼水洗,获得所述重组基因工程菌固定化细胞;所述载体为活性炭、硅藻土、膨润土或蒙脱土;所述交联剂为戊二醛、乙二醛或双醛淀粉;所述聚乙烯亚胺分子量为600~70000。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述磷酸缓冲液体积用量以湿菌体重量计为

5‑20mL/g;所述载体质量用量为菌体质量的2~10%;所述聚乙烯亚胺用量以菌体质量计为

1~10mL/100g;所述交联剂用量以菌体质量计为1~10mL/100g。

9.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述反应体系中,催化剂用量以反应介质体+积计10‑50g/L,底物终浓度100‑400mM,甲酸铵终浓度100‑800mM,NAD终浓度0.05‑2mM。