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专利号: 2019104292139
申请人: 青岛汉德森生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种杂交瘤细胞株制备方法,包括如下步骤:免疫、测定血清效价、融合、细胞株筛选;

所述免疫步骤包括如下步骤:

(1)取6-8周Balb/c健康小鼠若干只;

(2)初次免疫,取抗原与弗氏完全佐剂体积比为1:1混合后乳化,形成油包水状态,对小鼠进行皮下多点注射;

(3)二次免疫,于第14天,取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1混合后乳化,形成油包水状态,对小鼠进行皮下多点注射;

(4)第三次免疫,于第28天,取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1混合后乳化,形成油包水状态,对小鼠进行皮下多点注射;

(5)第四次免疫,于第42天,取抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1混合后乳化,形成油包水状态,对小鼠进行皮下多点注射;

所述测定血清效价步骤具体包括如下步骤:

(1)提前将预包被好的酶标板取出置于室温下至少半小时;

(2)分别对免疫小鼠进行眼眶采血;

(3)待血液完全凝固后,3000r/min离心5min,取上清液;

(4)将上清液用PBS进行倍比稀释;

(5)加样:在已恢复室温的酶标板的微孔条中,分别加入稀释后上清100μl,以PBS作为空白对照,正常鼠血清对阴性对照,置37℃温育30min;

(6)洗板:用洗板机吸去孔内液体,将洗液注满每孔,反复3次,最后在吸水纸上拍干;

(7)加酶:每孔加入酶标记物100μl,用封板膜覆盖,置37℃孵育30min;

(8)洗板:用洗板机吸去孔内液体,将洗液注满每孔,反复3次,最后在吸水纸上拍干;

(9)显色:每孔加入TMB底物100μl,用封板膜覆盖,置37℃避光孵育15分钟;

(10)终止:每孔加终止液50μl,震荡使孔内液体混合均匀,立即测试结果;

(11)读数:用酶标仪双波长读取各孔的吸光度值;

所述细胞株筛选包括如下步骤:

(1)杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检测活性;

(2)根据(1)中上清液活性检测结果选取合适的孔进行第一次亚克隆;

(3)待第一次亚克隆细胞团长至明显可见时,吸取(2)中上清液,检测活性;

(4)根据(2)中上清液活性检测结果选取合适的孔进行第二次亚克隆,同时扩至24孔板进行增殖;

(5)待第二次亚克隆细胞团长至明显可见时,吸取(4)中上清液,检测活性;

(6)根据(5)中上清液活性检测结果选取合适的孔扩至24孔板进行增殖;

(7)待(6)中24孔板细胞长至汇合率为80%后,吸取上清液,检测活性;

(8)根据(7)中上清液活性检测结果选取合适的孔扩至25cm细胞培养瓶进行增殖、冻存保种。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备方法所制备出的杂交瘤细胞株,其特征在于:包括生物保藏编号为CGMCC No.17681、CGMCC No.17682的杂交瘤细胞株2株。

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株制备方法所制备出的杂交瘤细胞株分泌产生的乙肝表面抗原单克隆抗体,其特征在于:所述单克隆抗体的类型为IgA、IgG。

4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株制备方法所制备出的杂交瘤细胞株分泌产生的乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法,其特征在于:该制备方法包括如下步骤:(1)将保存的杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔进行腹水生产;

(2)将腹水用滤纸、玻璃纤维与无纺布各两层进行过滤;

(3)过滤后腹水用A液体积比为1:1稀释,A液由20mM PB和0.3M NaCl组成,A液的pH=

7.5;

(4)稀释后腹水混匀测OD后上样,上样速度为5ml/min;

(5)上样后用A液平衡完全,平衡速度5ml/min;

(6)A液平衡后,用B液洗脱并接样,洗脱速度10ml/min,B液为0.1M甘氨酸,B液的pH=4;

(7)接样过程中,吸光值上扬后换管接样,直至OD<0.2;

(8)接样后立即用2M Tris调pH=7.5,加入NaN3至NaN3的终浓度为万分之一;

(9)B液洗脱并平衡完全后,用A液平衡完全;

(10)将得到的腹水分别跑电泳、测活性;

(11)纯度符合要求后,进行胶体金筛选。

5.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株制备方法所制备出的杂交瘤细胞株分泌产生的乙肝表面抗原单克隆抗体所制备的试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括用上述乙肝表面抗原单克隆抗体所制成的金标垫,所述金标垫的制备方法包括如下步骤:(1)包被抗原;

(2)烧40nm的胶体金溶液;

(3)将乙肝表面抗原单克隆抗体稀释至1mg/ml,标记金溶液;

(4)抗体条件:确定K值,固定乙肝表面抗原单克隆抗体的用量,连续增加K值;用微量进样器将碳酸钾溶液加入到红溶液中,混匀,五只为一组;然后再加入相同的乙肝表面抗原单克隆抗体量,混匀;然后每管滴入三滴2M NaCl溶液,混匀观察有无聚沉现象,直至出现溶液颜色不再变化,此时的碳酸钾的体积为我们所要的K值;

(5)确定Ab值,固定K值,不断改变乙肝表面抗原单克隆抗体的用量;先用微量进样器加入碳酸钾溶液至红溶液中,混匀;然后再加入不同体积的乙肝表面抗原单克隆抗体,混匀;

然后每管滴入三滴2MNaCl溶液,混匀观察有无聚沉现象,直至出现溶液颜色不再变化,此时所需乙肝表面抗原单克隆抗体最小用量为Ab值;

(6)配置离心小样进行离心:向离心管中加入碳酸钾溶液,混匀;随后加入乙肝表面抗原单克隆抗体,混匀;再次向离心管中分别加入400μl稳定剂和200μl的终止剂混匀;先以

5000r/min离心20min,静置10min;用移液管移取底部沉淀于离心管中;将离心后的上清液再以8000r/min离心20min,静置10min;用移液管移取底部沉淀于离心管中,此时离心后的上清液即为小样;

(7)测小样的OD值,将小样稀释至OD=20,配置金标垫小样溶液;

(8)做金标垫小样:用移液枪移取配制好的金标垫小样溶液,涂到空白金标垫上直至整个金标垫涂抹均匀。