利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2018116212785
申请人: 济南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-04-09
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器,其特征在于,包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液;

所述的复合探针I由U-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成;

所述的复合探针II由S-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成;

所述的环状模板由线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合,在T4 DNA连接酶的作用下,形成环形模板-连接引物的复合体,当有核酸外切酶I和外切酶III存在时,对引物进行消化,从而形成环形模板;

所述的碱基序列如下:

U-DNA序列如SEQ No.1所示;

线性挂锁探针C-DNA序列如SEQ No.2所示;

连接探针L-DNA序列如SEQ No.3所示;

S-DNA序列如SEQ No.4所示;

所述的U-DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U,代表尿嘧啶碱基;U-DNA的3’端修饰Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用;

所述的C-DNA中的5’端修饰磷酸基团;

所述的S-DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团,然后还有个四氢呋喃修饰位点,即无嘌呤无嘧啶位点;第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团;3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。

2.权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)环形模板构建;

(2)复合探针I、复合探针II的制备;

(3)均相反应;

(4)荧光检测:荧光仪设置激发波长为486 nm,检测518 nm处荧光强度,检测范围为450 nm-530 nm。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)具体工艺为:S1 将 C-DNA和L-DNA 6 加入到EP管中,在95 ℃下孵育5 min,缓慢冷却至室温;随后放入到16 ℃水浴中,过夜反应;

S2 然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶,将其在16℃下反应20 h;

S3灭活体系中的T4 DNA连接酶;

S4 向上述反应体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ,37℃下反应2 h;再将反应体系85℃水浴加热10 min,得环形模板,4℃条件下保藏备用。

4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)中复合探针I的制备工艺为:将灭菌水、环形模板、U-DNA、PBS缓冲液加入到EP管中,在37℃孵育40 min,使环形模板与U-DNA充分杂交,制备成复合探针I。

5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)中复合探针II的制备工艺为:将环形模板、PBS缓冲液、灭菌水、S-DNA在37℃孵育40 min制备成复合探针II。

6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)具体工艺为:将灭菌水,

10×buffer缓冲液、复合探针I、复合探针II、UDG、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入EP管中,在37 ℃下,孵育2 h。

7.根据权利要求2或6所述的制备方法,其特征在于,所述的10×buffer缓冲液为:50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、10 mM (NH4)2SO4、4 mM DTT;pH 7.5。