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专利号: 2021113698774
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于CRISPR的荧光生物传感器,其特征在于,所述荧光生物传感器至少包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA;

其中,所述发夹探针由5个结构域构成,包括1个检测探针的结合域,2个Nt.BbvCI切刻酶的识别域以及2个二次链置换扩增反应反应模板域;

所述检测探针标记有DNA糖基化酶切除修复位点;

所述信号探针序列两末端修饰有荧光基团和猝灭基团,且其可以被激活的CRISPR/Cas12a效应子切割;

所述crRNA为单链CRISPR RNA,其与Cas核酸酶和靶DNA结合。

2.如权利要求1所述的荧光生物传感器,其特征在于,所述发夹探针末端用C3 spacer间隔子修饰;

所述检测探针标记8‑oxoG碱基;优选的,所述检测探针从5'端开始的第18nt上标记8‑oxoG碱基;

所述荧光基团为Cy5,所述猝灭基团为BHQ2。

3.如权利要求1所述的荧光生物传感器,其特征在于,所述荧光生物传感器还包括多核苷酸激酶和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1,优选为多核苷酸激酶;

以及,Nt.BbvCI限制性内切酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和Cas12a;

优选的,所述荧光生物传感器还包括反应缓冲液。

4.权利要求1‑3任一项所述荧光生物传感器在检测DNA糖基化酶中的应用。

5.一种检测DNA糖基化酶的方法,其特征在于,所述方法包括采用权利要求1‑3任一项所述荧光生物传感器进行检测。

6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述方法包括:将待测样品与权利要求1‑3任一项所述荧光生物传感器进行孵育,然后终止反应;

优选的,所述孵育条件为:在30~40℃(优选为37℃)孵育10‑60分钟(优选为30分钟),然后在60‑70℃(优选为65℃)加热5‑30分钟(优选为10分钟)终止反应。

7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法包括:将待测样品、发夹底物、PNK或APE1、Nt.BbvCI切刻酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Cas12a、crRNA和信号探针置于反应缓冲液中孵育,终止反应后进行荧光检测分析。

8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述待测样品为生物样品,包括离体的血液、体液、组织和细胞;

所述发夹底物由检测探针与发夹探针复合获得。

所述DNA糖基化酶包括人8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶、甲酰嘧啶[fapy]‑DNA糖基化酶、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶、尿嘧啶‑DNA糖基化酶、胸腺嘧啶‑DNA糖基化酶;优选的,所述DNA糖基化酶包括人8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶和甲酰嘧啶[fapy]‑DNA糖基化酶。

9.权利要求1‑3任一项所述生物传感器和/或权利要求5‑8任一项所述检测方法在DNA糖基化酶相关药物筛选和/或生物样品酶分析中的应用。

10.如权利要求9所述应用,其特征在于,所述DNA糖基化酶相关药物包括DNA糖基化酶抑制剂和DNA糖基化酶激活剂;

所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。