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专利号: 2018115667035
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-02
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:包括,GnT‑II的原核表达:在大肠杆菌中表达人源的GnT‑IIΔTM,所述GnT‑IIΔTM为截掉N端

1~87个氨基酸的人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II;

GnT‑II的纯化:将原核表达的所述GnT‑IIΔTM进行纯化;

具体步骤如下:将GnT‑II编码基因中编码N端1~87个氨基酸的多核苷酸截去,构建原核表达载体;

转化原核宿主菌,涂布于平板培养基,过夜;

筛选宿主菌单菌落,接种于LB液体培养基,振荡培养过夜,得菌液;

将所述菌液接种于TB液体培养基,振荡培养,再降温培养;

加入诱导剂,振荡培养,离心收集菌体,重悬于缓冲液中,超声破碎,离心,收集上清液;

用所述缓冲液清洗亲和层析柱,将所述上清液上样,收集洗脱液,即得人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II。

2.如权利要求1所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述GnT‑II为GnT‑IIΔTM,aa 88‑443;所述原核表达载体为pET28a‑GnT‑IIΔTM;所述转化原核宿主菌为ROSETTA。

3.如权利要求1或2任一所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述平板培养基为LB、卡那霉素和氯霉素平板培养基;所述LB液体培养基为LB、卡那霉素和氯霉素液体培养基;所述TB液体培养基为TB、卡那霉素和氯霉素液体培养基;所述缓冲液为Tris‑HCl、NaCl缓冲液;所述诱导剂为IPTG;所述亲和层析柱为镍离子亲和层析柱。

4.如权利要求3所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述缓冲液,其Tris‑HCl、NaCl浓度分别为25mM,150mM。

5.如权利要求1、2或4任一所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述诱导剂浓度为0 .1mM。

6.如权利要求5所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述缓冲液的pH为8 .0。

7.如权利要求1、2或6所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述接种于LB液体培养基,振荡培养过夜,其培养温度为37℃;所述将菌液接种于TB液体培养基,振荡培养,再降温培养,其温度为37℃,其振荡速率为200r/min,其振荡时间为3h,其降低温度至16℃,其降温培养时间为1h;所述加入诱导剂,振荡培养,其振荡培养频率为

200r/min,其培养时间为20h;所述离心收集菌体,其离心速率为9000r/min,其离心时间为

60min。

8.如权利要求7所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述将菌液接种于TB液体培养基,振荡培养,再降温培养,其所得菌液OD600为0.6~0.8。

9.如权利要求1、2或8所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法,其特征在于:所述用缓冲液清洗亲和层析柱,上样所述上清液,收集洗脱液,其缓冲液体积与所述亲和层析柱体积比为10∶1,其缓冲液流速为1min/mL。

10.利用权利要求1~9所述方法制备的人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II,其特征在于:所述人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II,其米氏常数为55 .98μM。