1.一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1的构建方法,其特征在于,所述氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1以氧化葡萄糖酸杆菌为出发菌株,敲除膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH基因,转入转氨酶基因Glms、乙酰转移酶基因GNA1和T7启动子基因构建而成;所述转氨酶基因Glms的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述乙酰转移酶基因GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)根据SEQ ID NO.1所示膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH基因,获取其左右两侧各800bp基因片段同源臂,克隆在载体pOJ260上,得到pOJ260△mGDH重组质粒;
(2)通过接合转移的方法,将pOJ260△mGDH重组质粒转移到氧化葡萄糖酸杆菌中,筛选得到接合子,再通过无抗传代进行第二次同源重组,筛选得到敲除mGDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌株Gluconobacter oxydans△mGDH;
(3)将T7启动子RNA Poly基因克隆在重组质粒pOJ260△mGDH上,获得含有T7启动子的重组质粒pOJ260△mGDH‑T7;
(4)将转氨酶基因Glms,乙酰转移酶基因GNA1,克隆在重组质粒pOJ260△mGDH‑T7上,得到含Glms、GNA1基因的重组质粒pOJ260△mGDH‑T7‑Glms‑GNA1;
(5)通过接合转移的方法,将步骤(4)的重组质粒pOJ260△mGDH‑T7‑Glms‑GNA1转移到步骤(2)的氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans△mGDH中,筛选得到氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1。
3.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1的构建方法,其特征在于:
所述T7启动子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1~3之一所述的方法构建得到的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1。
5.一种权利要求4所述的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1在发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用的方法为:将氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1菌株划线至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的山梨醇固体培养基平板上,30℃培养30h,挑取单菌落接种至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的山梨醇液体培养基中,30℃培养18h,然后再按10%体积的接种量接种至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的发酵培养基中,30℃、220rpm振荡培养至OD600=0.7时加入终浓度0.2mM的IPTG,在30℃培养24h后,获得含N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵液,分离纯化,获得N‑乙酰氨基葡萄糖;
山梨醇液体培养基组成:20g/L山梨醇,3g/L酵母粉,10g/L蛋白胨,1g/LK2HPO4,0.2g/LMgSO4,溶剂为去离子水;山梨醇固体培养基是在山梨醇液体培养基中加入20g/L的琼脂制得;
发酵培养基组成:100mM葡萄糖,20g/L山梨醇,3g/L酵母粉,10g/L蛋白胨,1g/L K2HPO4,
0.2g/LMgSO4,2g/L谷氨酰胺,溶剂为去离子水。