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专利号: 2016102498735
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶,其特征在于,所述水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的编码区序列SEQ ID NO:3,序列长1482bp,编码493个氨基酸,相对分子量为54.45kD,等电点为6.24,具有UDPGP保守结构域,N-端不含跨膜结构和信号肽;

所述水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的蛋白序列:SEQ ID NO:4。

2.一种如权利要求1所述水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:步骤一,OsUAP2生物信息学分析利用NCBI查询基因和蛋白序列;利用ProtParam分析蛋白分子量和等电点;蛋白质的保守结构域分析利用NCBI;蛋白信号肽利用SignalP4.1 Server预测;

步骤二,体外酶活性测定;包括:载体构建、连接反应、重组蛋白的诱导表达与纯化、酶促反应过程、UDPG含量测定;

步骤三,转基因水稻材料的创建及表型的鉴定,构建该基因全长CDS过表达载体,并通过用农秆菌介导的方法转化水稻品种越光。

3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述载体构建具体包括:所用到的载体分别为pEASY-Blunt载体、原核表达载体PET28a、植物过表达载体pCAMBIA1307;

构建原核表达载体引物:SEQ ID NO:1

F:GAATTCATGAAGGAGATAGTGGTTGGGTCGGTG;

R:ACGCGTCGACCTAGAAGGAAATCTCACTCGGCGC;

构建1307过表达载体引物:SEQ ID NO:2

F:AATGGATCCATGGCGGAGATCGTGGTGG;

R:AGGAATTCTAACTGCAAGAGCTCAAG;

以野生型水稻品种Kitaake cDNA为模板,分别用带有酶切位点和保护碱基的引物扩增OsUAP2基因全长cDNA,亚克隆到pEASY-Blunt载体上,酶切后与相同酶切位点的PET28a载体或pCAMBIA1307连接。

4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述连接反应包括:亚克隆载体构建

目的DNA片段                             4μLpEASY-Blunt                             1μL

25℃连接10min;

表达载体构建

目的DNA片段                             5μL回收的酶切载体                          3μLT4DNA ligase                          1μL

10×T4ligase buffer                     1μL

16℃连接过夜。

5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述重组蛋白的诱导表达与纯化,将重组载体转化原核表达菌株BL21,进行重组蛋白的原核诱导表达和体外纯化,具体包括:重组蛋白的原核诱导表达:将阳性克隆接种到3mLLB培养基,37℃,220rpm摇菌6~8h;

将上述菌液全部接种到50mL LB培养基,220rpm摇菌,使菌液达到饱和状态;取上述菌液

20mL,接种到1L LB液体培养基,37℃,220rpm摇菌;待菌液A600=0.4~0.6,将摇床温度降至

16℃;加入0.2mM IPTG诱导8h;4℃,6000rpm,离心5min,收集菌体;

His-tag重组蛋白体外纯化:往重组载体转化的BL21菌体中加入10mLA液,悬浮菌体,用超声破碎仪破碎菌体;4℃,12000rpm,离心30min,取上清;Bio-Rad蛋白低压层析系统进行纯化,先用超纯水冲洗柱床至紫外检测器的吸收值靠近基线水平;再用3-5倍柱体积A液冲洗;按A液:细菌裂解上清=1:1上样,流速1mL/min,上样完成后,用A液冲洗柱床,尽量冲去没有结合的蛋白质和杂质,直至紫外检测器的吸收值靠近基线水平,用B液进行洗脱,流速

1mL/min,2mL收集管分步收集紫外检测到的重组蛋白,以上纯化步骤均在低温层析柜中完成;

重组蛋白SDS-PAGE电泳。

6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述酶促反应过程:反应缓冲液:MgCl2            5mM

UDPG或Glc-1-P    0.8mM

Tris-HCl(pH7.5)  10mM

反应体系为1mL:在新鲜配制的反应缓冲液中加入5μg原核表达蛋白,再加入100mM焦磷酸钾盐10μL或20mM UTP 10μL,迅速混匀,37℃反应,置于沸水中煮5min。

7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述UDPG含量测定:用HPLC检测反应体系中UDPG含量,色谱条件为:色谱柱:Agilent Zorbax Carbohydrate;流动相:0.125mol/L KH2PO4缓冲液-乙腈溶液,流速1mL/min;检测波长262nm;柱温:30℃;进样体积:10μL。

8.一种如权利要求1所述水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶在催化UDPG的合成和降解的双向反应的应用。