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专利号: 2018108908395
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-05-07
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体,其特征在于,所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板,利用定点突变技术构建而成。

2.根据权利要求1所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体,其特征在于,所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸得到的NA-ADH-M1、NA-ADH的第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M2和NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体,其特征在于,所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3。

4.如权利要求1至3任一所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用。

5.根据权利要求4所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用,其特征在于,包括以下步骤:(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点,然后连接到pET26b(+)上,获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体;

(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中,培养菌株得菌株培养液;

(3)将菌株培养液离心处理后收集菌体,然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液;

(4)向含有β-羰基十四烷酸酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液的反应液,控制pH值为6.8~7.3、温度为30~37℃,反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸酯。

6.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用,其特征在于,步骤(2)中菌株培养方法如下:挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中振荡培养,将1mL的培养液加入到含卡那霉素的80~120mL TB培养基中振荡培养至培养基的OD600为3.0,向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L,然后将培养基置于25℃诱导培养12~24h。

7.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用,其特征在于,步骤(3)中离心速度为5000g,离心时间10~20min。

8.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用,其特征在于,步骤(4)中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份+分别为:0.1g/L的NAD、30g/L的含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液;底物的添加量为3~6g底物/100mL反应液。

9.根据权利要求5至8任一所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用,其特征在于,所述(R)-β-羟基十四烷酸酯的结构式为:其中,R表示1至8个碳原子的饱和烷基。