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专利号: 2017101772421
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于检测樟疫霉菌的引物,其特征在于,所述引物为鉴定樟疫霉菌的特异性引物PCINF/PCINR,所述引物PCINF/PCINR序列如下:PCINF:5'- CGCTAACGTCGTTGTTGTTT -3',PCINR:5'- CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'。

2.一种使用权利要求1所述引物进行巢式PCR检测樟疫霉菌的方法,其特征在于,包括以下步骤::(1)提取待测样品基因组DNA,低温保存备用;

(2)巢式PCR第1轮扩增:以步骤(1)提取的DNA为模板,利用Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R进行第1轮扩增,所述巢式PCR第1轮扩增反应体系和反应程序如下:PCR反应体系25 µL,包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL,10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL,DNA模板1.0µL,用无菌超纯水补足至25 µL;

扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min;

(3)巢式PCR第2轮扩增,待步骤(2)第一轮PCR扩增结束后,取1.0μl 第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板与樟疫霉菌特异性引物PCINF/PCINR组合进行第2轮PCR扩增,所述巢式PCR第2轮扩增反应体系和反应程序如下:PCR反应体系25 µL,包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL,10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL,第1轮PCR扩增产物或稀释液作为DNA模板1.0µL,用无菌超纯水补足至25 µL;

扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min、59℃退火30 S、72℃延伸1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min;

(4)凝胶电泳检测:取5.0µL步骤(3)第2轮PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离,电压为4-5V/cm,电泳40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察,根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断,如果能特异性地扩增出320bp的产物,即可判断所述的检测样品中存在樟疫霉菌,否则未检出。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R,所述引物ph1F/Yph2R的序列如下:ph1F:5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3',

Yph2R:5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'。

4.如权利要求1所述的引物在樟疫霉菌引起病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。