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专利号: 2016110843883
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法,其特征在于,包括以下具体步骤:(1)提取待测样品基因组DNA;

(2)巢式PCR第1轮扩增:所用引物为:

ph1F:5′-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3′,Yph2R:5′-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3′;

以步骤(1)提取的DNA为模板,利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增;

PCR反应体系25L:2×TaqPCRMasterMix12.5L,10mol/L的ph1F/Yph2R引物各1.0L,DNA模板1.0L,用无菌超纯水补足至25L;

PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min、58℃退火30S、72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min;

(3)巢式PCR第2轮PCR扩增:所用引物对为:

PCOF:5′-AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA-3′,PCOR:5′-AATCTCATGCAGCCACTGCT-3′,待步骤(2)第一轮PCR扩增结束后,取1.0μl第一轮PCR扩增产物稀释1-100倍为模板;

PCR反应体系25L:2×TaqPCRMasterMix12.5L,10mol/L的PCOF/PCOR引物各1.0L,DNA模板1.0L,用无菌超纯水补足至25L;

PCR条件为:扩增参数为95℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸30s,共

35个循环,最后72℃延伸10min;

(4)凝胶电泳检测:取5.0L步骤(3)第2轮PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离,电压为4-5V/cm,电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察,根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断,如果能特异性地扩增出327bp的产物,即可判断所述的检测样品中存在芋疫霉菌;若无特异性条带则说明样品中无芋疫霉菌。

2.利用权利要求1所述的一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法在芋头疫病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。