1.一种苜蓿疫霉菌的巢式PCR检测引物,其特征在于,所述引物为苜蓿疫霉菌特异性引物PMF/PMR,其序列为:PMF:5'- GTCTACAGTGGATTTGGATCTCTTG -3',PMR:5'- CAAAATATAACAGTAA- AGTTGAGTTCG -3'。
2.利用权利要求1所述的检测引物进行苜蓿疫霉菌巢式PCR检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)从待检测样品中提取基因组DNA;
(2)巢式PCR第1轮扩增:以步骤(1)提取的DNA为模板,利用Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增,扩增反应体系和反应程序如下:PCR反应体系25 µL,包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL,10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL,DNA模板1.0µL,用无菌超纯水补足至25 µL;扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min;
(3)巢式PCR第2轮扩增:待步骤(2)第一轮PCR扩增结束后,取1.0μl 第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液(1-100倍)为模板与权利要求1所述引物PMF/PMR组合进行第2轮PCR扩增,PCR扩增的条件为:PCR反应体系25 µL,包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL,10 µmol/L的 PMF/PMR引物各1.0µL,以第1轮PCR扩增产物为DNA 模板1.0µL,用无菌超纯水补足至25 µL;扩增参数为95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min;
(4)凝胶电泳检测:取5.0µL步骤(3)第2轮PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离,电压为4-5V/cm,电泳40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察,根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断,如果能特异性地扩增出约225bp大小的产物,即可判断所述的检测样品中存在苜蓿疫霉菌。
3.根据权利要求2所述的PCR检测方法,其特征在于:所述的Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R,其序列为:ph1F:5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3',Yph2R:5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATC- T-3'。
4.如权利要求1所述的引物在苜蓿疫霉菌检测和鉴定中的应用。