1.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测引物,其特征在于:所述的检测引物包括如下:VapB-
1F:5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’;
VapB -1R:5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’;
VapB-2F:5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’;
VapB-2R:5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’。
2.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤A、基因组DNA提取:采用CTAB法提取西瓜果斑病菌基因组DNA或发病植物组织DNA;
步骤B、第一轮PCR扩增:以步骤A得到的DNA样品为模板,采用权利要求1中所述的引物VapB -1F/ VapB -1R经过PCR扩增得到第一轮PCR产物;
PCR反应体系25μl:基因组DNA 1μl,10×PCR反应缓冲液含Mg2+ 2.5μl,各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl,5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl,10 μmol/L的VapB-1F引物1μl,10 μmol/L的VapB-1R引物1μl,灭菌超纯水补足至25μl;PCR扩增程序:94℃预变性4min, 94℃变性
30sec,55℃退火30 sec,72℃延伸45sec,共30个循环;72℃延伸10min;4℃保存;
步骤C、第二轮PCR扩增:以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板,采用权利要求1所述的引物VapB-2F/VapB-2R经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物;
PCR反应体系25μl:第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液1μl,10×PCR反应缓冲液含Mg2+ 2.5μl,各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl,5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl,10 μmol/L的VapB-2F引物1μl,10 μmol/L的VapB-2R引物1μl,灭菌超纯水补足至25μl;
PCR扩增程序:94℃预变性4min, 94℃变性30sec,55℃退火30 sec,72℃延伸40sec,共30个循环;72℃延伸8min;4℃保存;
步骤D、PCR扩增产物检测:取8 μl第二轮PCR扩增产物,采用1%琼脂糖凝胶,在80 V 电压下电泳30min,之后置于EB内染色20min后取出,于凝胶成像系统下观察拍照,如果存在
175bp的特异条带,则确定所检测的病菌为西瓜果斑病菌。