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专利号: 2016112493225
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测引物,其特征在于:所述的检测引物包括如下:VapB-

1F:5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’;

 VapB -1R:5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’;

VapB-2F:5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’;

VapB-2R:5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’。

2.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤A、基因组DNA提取:采用CTAB法提取西瓜果斑病菌基因组DNA或发病植物组织DNA;

步骤B、第一轮PCR扩增:以步骤A得到的DNA样品为模板,采用权利要求1中所述的引物VapB -1F/ VapB -1R经过PCR扩增得到第一轮PCR产物;

PCR反应体系25μl:基因组DNA 1μl,10×PCR反应缓冲液含Mg2+ 2.5μl,各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl,5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl,10 μmol/L的VapB-1F引物1μl,10 μmol/L的VapB-1R引物1μl,灭菌超纯水补足至25μl;PCR扩增程序:94℃预变性4min, 94℃变性

30sec,55℃退火30 sec,72℃延伸45sec,共30个循环;72℃延伸10min;4℃保存;

步骤C、第二轮PCR扩增:以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板,采用权利要求1所述的引物VapB-2F/VapB-2R经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物;

PCR反应体系25μl:第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液1μl,10×PCR反应缓冲液含Mg2+ 2.5μl,各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl,5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl,10 μmol/L的VapB-2F引物1μl,10 μmol/L的VapB-2R引物1μl,灭菌超纯水补足至25μl;

 PCR扩增程序:94℃预变性4min, 94℃变性30sec,55℃退火30 sec,72℃延伸40sec,共30个循环;72℃延伸8min;4℃保存;

步骤D、PCR扩增产物检测:取8 μl第二轮PCR扩增产物,采用1%琼脂糖凝胶,在80 V 电压下电泳30min,之后置于EB内染色20min后取出,于凝胶成像系统下观察拍照,如果存在

175bp的特异条带,则确定所检测的病菌为西瓜果斑病菌。