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专利号: 2016110729426
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型,其特征在于,按以下方法构建:

(1)网络数据库的建立:根据出芽短梗霉全基因组测序结果和GO、KEGG、Uniprot数据库收集出芽短梗霉的基因注释信息,然后用VBA程序提取需要的出芽短梗霉菌的基因注释信息,添加聚苹果酸合成的特征反应,得到网络数据库;

(2)数据库的精炼和校准:从文献和数据库提取生物量组成模拟所需组分信息,将已有的网络数据库标准化并建立物种特异的详细反应列表,并对网络反应进行手动精炼,得到精确的出芽短梗霉菌代谢网络模型数据库;

(3)数学模型的建立:将已有的数据库文件内容转化为转换成系统生物学语言格式的文件,然后通过基于Matlab平台的COBRA工具包读取将其转化为数学模型;

(4)模型的验证与分析:以Matlab平台的COBRA工具包进行通量平衡分析,GLPK为线性解包进行模拟计算。

2.权利要求1所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型在预测提高出芽短梗霉代谢物产量靶点基因中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述代谢物为聚苹果酸。

4.利用权利要求1所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型预测提高出芽短梗霉聚苹果酸产量靶点基因的方法,其特征在于:根据已构建的出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型,以生物量合成反应为目标函数,逐渐增大聚苹果酸分泌反应,得到多组流量数据,并通过分析不同聚苹果酸合成率状态下的碳流量分配情况,再利用鲁棒性分析方法,确定靶点基因对出芽短梗霉聚苹果酸产量的影响。

5.权利要求1所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型指导下获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉的方法,其特征在于:将出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因在出芽短梗霉中过表达即获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因,然后构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体,再将重组载体利用农杆菌介导将含丙酮酸羧化酶基因的T-DNA整合入出芽短梗霉基因组中,并通过RT-qPCR验证丙酮酸羧化酶基因转录水平上调,进一步经发酵罐发酵验证得到高产聚苹果酸的出芽短梗霉。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的方法如下:以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物,出芽短梗霉基因组DNA为模版进行PCR扩增,获得出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体的方法为:先将丙酮酸羧化酶基因连入真菌过表达载体pBARGPEI的Sma I和EcoR I酶切位点之间,获得重组表达载体pBARGPE1-pyc,然后以重组表达载体pBARGPE1-pyc为模板,SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增,扩增产物连入pk2-PgpdA-hyg-TtrpC载体的EcoR I酶切位点处,得过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体。

9.权利要求5~8任一项所述的方法,其特征在于:所述出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.权利要求5~8任一项所述的方法,其特征在于:所述出芽短梗霉为出芽短梗霉CCTCCM2012223。