欢迎来到利索能及~ 联系电话:18621327849
利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2016101105118
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1. 一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

1)金枪鱼碎肉的酶解:取金枪鱼碎肉匀浆,按固液比1g:10mL~15mL加入Gly-NaOH缓冲液,用HCl或NaOH调节pH到9.0~10.0,将溶液温度调制55~65℃,按照金枪鱼碎肉质量的

1.0%~1.5%加入碱性蛋白酶,酶解时间3.5h~4.0h后,酶解液于90~95℃保温10~15min,灭酶活;将酶解液温度调至45~55℃,调节pH到6.0~7.0,按照金枪鱼碎肉质量的0.8%~

1.0%加入复合风味蛋白酶,酶解时间2.5h~3.0h,酶解液于90~95℃保温10~15min后降至室温,于8000~10000rpm离心15~20min,取上清液;

2)金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备:取上述上清液,采用1kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液;将超滤酶解液调pH值至2.5 3.5,按照物料与活性炭~颗粒比为10~15:1将超滤酶解液以0.3~0.5mL/min流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中,上样完成后,采用2~3倍柱体积的1:1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱,收集洗脱液,干燥,得活性炭精制多肽;将活性炭精制多肽配成10~20mg/mL的溶液,调pH值至6.5~7.5,缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为10~15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中,用2~3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质,再用2~3倍柱体积的95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱物,喷雾干燥,即为金枪鱼碎肉高F值寡肽;

3)金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf 2-ARE通路激活剂制备:将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,得Nrf 2-ARE通路激活剂;

其中所述步骤1)中的Gly-NaOH缓冲液为0.05mol/L,pH值为9.5;碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×105U/g;复合风味蛋白酶的酶活力≥1×103LAPU/g;

所述步骤1)中的金枪鱼为鲣鱼即Katsuwonus pelamis;

所述步骤3)的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为:

凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20~30mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,流速为0.5~0.8mL/min,洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测,按峰合并试管内溶液,比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响,选择Nrf 2蛋白质水平最高组分冻干,即为凝胶层析酶解物;

反相高效液相色谱纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100μg/mL的溶液,利用反相高效液相色谱进行纯化,收集对Nrf2蛋白质累计水平最高的多肽,经反相高效液相色谱检测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Glu-Leu-Val-Trp,ESI-MS测定分子量为658.76 Da;所述反相高效液相色谱条件为:进样量10~15μL;色谱柱是规格为250mm×4.6mm,填料颗粒直径为5μm的KromasilC18;流动相为水-乙腈梯度洗脱,0~40min乙腈浓度,由0匀速升至50%;洗脱速度0.8 1.0mL/min;紫外检测波长220nm。

~