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专利号: 2025105353703
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-06
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种腈水解酶突变体,其特征在于,所述腈水解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一:(1)第126位精氨酸突变为丝氨酸;(2)第126位精氨酸突变为丝氨酸且第184位丝氨酸突变为缬氨酸。

2.一种包含权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化2‑取代丁二腈合成γ‑氨基丁酸衍生物中的应用,其特征在于,所述应用的方法为:以含所述腈水解酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎提取的纯酶为催化剂,以式Ⅰ中的2‑取代丁二腈为底物,以pH6‑8的缓冲液为反应介质构成转化体系,在20‑40℃、100‑200 rpm条件下进行转化反应,获得含式Ⅱ中的3‑取代‑3‑氰基丙酸的反应液,再经加氢反应,获得γ‑氨基丁酸衍生物;

Ⅰ               Ⅱ

式Ⅰ中R为苯基、间氯苯基、对氟苯基、对氯苯基、对甲基苯基、邻氯苯基、异丁基、丙基;

式Ⅱ中R同式Ⅰ中R。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述转化体系中底物加入浓度为10‑200 g/L;催化剂加入量以湿菌体计为5‑20 g/L。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述反应介质为pH 7.4、50mM的磷酸缓冲液。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述湿菌体按如下方法制备:

(1)平板培养:将含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基,经37℃过夜活化,获得单菌落;

(2)种子培养:将单菌落接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,180 rpm培养10‑12 h,获得种子液;

(3)发酵培养:将种子液以体积浓度2%接种量接种至新鲜的含有终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至菌体浓度OD600达到0.5~0.7,再向培养液中加入终浓度为0.1 mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷,28℃诱导培养12 h,4℃、8000 rpm条件下离心

10 min,收集湿菌体。

7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述加氢反应是将式Ⅱ中的3‑取代‑3‑氰基丙酸与雷尼镍进行加氢反应,反应压力为2 MPa,反应温度为室温,搅拌速度为600 rpm,反应时间4 h;所述雷尼镍与3‑取代‑3‑氰基丙酸投料质量比0.5:1。