利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2025104382893
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种热稳定性提高的羟基类固醇脱氢酶突变体,其特征在于,所述羟基类固醇脱氢酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行下列之一单位点突变:(1)第50位缬氨酸突变为丙氨酸;(2)第50位缬氨酸突变为谷氨酸;(3)第126位丙氨酸突变为异亮氨酸;(4)第

132位丙氨酸突变为组氨酸;(5)第173位异亮氨酸突变为亮氨酸;(6)第203位丙氨酸突变为脯氨酸。

2.一种权利要求1中所述的羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因。

3.一种含权利要求2所述羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的重组表达载体。

4.一种含权利要求2所述羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述羟基类固醇脱氢酶突变体在催化鹅去氧胆酸合成7‑酮石胆酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用为:以含羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后离心的上清液为催化剂,+以鹅去氧胆酸作为底物,加入NAD 、丙酮酸钠和乳酸脱氢酶,以pH 6‑9的缓冲液为反应介质构成转化体系,在20‑40℃、600 rpm条件下进行转化反应,获得含7‑酮石胆酸的转化液。

+

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,转化体系中,底物加入浓度为50‑150g/L;NAD加入浓度为1‑5mM;丙酮酸钠加入浓度为100‑500mM;催化剂加入量以破碎前湿菌体计5‑

15g/L,或以蛋白含量计5‑15 mg/L;所述乳酸脱氢酶以含乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后离心的上清液形式加入,加入量以破碎前湿菌体计1‑

10g/L;所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述湿菌体按如下方法制备:将所述含羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基,37 ℃、180 rpm培养10 h,获得种子液;将种子液以体积浓度1.0%的接种量接种到新鲜的含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃、180 rpm培养至OD600=

0.6 0.8,再向培养液中加入终浓度为0.2 mM的异丙基硫代半乳糖苷,28 ℃培养12 h后,4 ~℃、8000 rpm离心10 min,获得所述的湿菌体。