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专利号: 2025101265116
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种源自链霉菌的细胞色素P450酶突变体,其特征在于,所述细胞色素P450酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10之一所示。

2.一种包含权利要求1所述细胞色素P450酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述细胞色素P450酶突变体在催化石胆酸制备熊去氧胆酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用的方法为:以共表达细胞色素P450酶突变体编码基因及氧化还原伴侣基因的工程菌经发酵培养、离心获得的湿菌体为催化剂,以石胆酸为底物,加入葡萄糖、NaCl、二甲基亚砜和甘油,以pH为5 10的缓冲液为反应介~质构成反应体系,在20 55 ℃、100 400 rpm条件下水浴反应结束后,用乙酸乙酯萃取反应~ ~液,取上层有机相,用真空浓缩仪器对乙酸乙酯进行挥发处理,获得产物熊去氧胆酸;所述氧化还原伴侣基因为编码来自恶臭假单胞菌的铁氧还蛋白还原酶 Pdr和铁氧还蛋白Pdx基因的组合。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述铁氧还蛋白还原酶Pdr的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示;所述铁氧还蛋白Pdx的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述共表达细胞色素P450酶突变体编码基因及氧化还原伴侣基因的工程菌按如下步骤构建:将细胞色素P450酶突变体插入到pET‑28a(+)的T7启动子下,与表达铁氧还蛋白还原酶Pdr和铁氧还蛋白Pdx的重组质粒pACYCDuet‑Pdr‑Pdx共同转入宿主菌,获得共表达工程菌。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述反应体系中底物加入浓度为1‑5 g/L,催化剂的用量以湿菌体重量计为50‑150 g/L,NaCl加入浓度10‑30mM,葡萄糖加入浓度50‑150 g/L,甘油加入浓度1‑5g/L,二甲基亚砜体积加入浓度1‑10%。

8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述反应介质为pH值7.4、200mM的磷酸钾缓冲液。

9.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述湿菌体按如下方法制备:

将共表达细胞色素P450酶突变体编码基因及氧化还原伴侣基因的工程菌接种至含50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的TB培养基中,在37 ℃培养6‑8 h,获得种子液;再将种子液以体积浓度2%接种量接种至新鲜的含有终浓度50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的TB液体培养基中,37 ℃、180‑200rpm培养至菌体浓度OD600达到0.3‑0.45,再向培养液中加入终浓度为0.1‑0.5mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷,28 ℃、180‑200rpm诱导培养10‑

12 h,4 ℃、8000‑12000 rpm条件下离心10 min,收集湿菌体。