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专利号: 2021102547094
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种细胞色素氧化酶CYP153A M. aq.的突变体A229S的编码基因,其特征在于,核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.一种细胞色素氧化酶CYP153A M. aq.的突变体A229S,其特征在于,所述突变体A229S的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.一种包含权利要求1所述突变酶的编码基因的重组表达载体。

4.一种包含权利要求1所述突变酶的编码基因的重组菌株。

5.权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌株在制备细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S的应用。

6.权利要求2所述细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S在制备10‑羟基癸酸中的应用。

7.如权利要求6所述应用,其特征在于,细胞色素氧化酶CYP153A M. aq. 的突变体A229S生产10‑羟基癸酸的方法,包括如下步骤:(1)构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3;

所述CYP153A A229S‑CPRBM3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;

(2)利用步骤(1) 制得的重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建大肠杆菌BL21(DE3)pET21b‑CYP153A A229S ‑CPRBM3,工程菌经筛选,诱导培养,制得诱导细胞;

(3)将步骤(2)制得的诱导细胞经转化培养基培养,制得静息细胞,然后向大肠杆菌BL21(DE3) pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸,培养制得10‑羟基癸酸。

8.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(1)中,构建重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3,包括如下步骤:以经过密码子优化的海杆菌(Marinobacter aquaeolei) 的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P450 NADH还原酶CPRBM3的融合酶基因为模板进行PCR扩增,CYP153A的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,然后将pET21b质粒用Nde I和Xho I进行双酶切,经多片段无缝克隆试剂盒连接,制得重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3;以重组质粒pET21b‑CYP153A‑CPRBM3为模板进行反向PCR扩增pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;扩增完成的pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3 PCR产物经过Dpn I酶去除原始的模板,再将其转化到大肠杆菌感受态中使其环化,得到重组质粒pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3;

PCR扩增体系如下,总体系25μL:

100μM上游引物1.0μL,100μM下游引物1.0μL,模板1.0μL,5U/μL phanta酶12.5μL,ddH2O 

9.5μL;

PCR扩增条件如下:

95℃预变性3min;95℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸4min30s ,循环30次;72℃延伸

5min。

9.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(2)中,筛选为将转化后的大肠杆菌工程菌接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,在35~40℃振荡筛选培养至菌液OD600为0.8~1.2。

10.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(2)中,诱导培养为将筛选培养的菌液降温至18~20℃适应0.5~1小时后,加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM、加入终浓度

0.5mM的FeCl3、终浓度0.5mM的5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐继续诱导培养18小时,分离细胞,制得诱导细胞。

11.如权利要求10所述应用,其特征在于,所述步骤(2)中,分离细胞为在5000rpm条件下离心15min,收集沉淀,然后用质量百分比浓度为0.85%的盐水洗涤。

12.如权利要求7所述应用,其特征在于,步骤(3)中向大肠杆菌BL21(DE3) pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.3‑0.7g/L,在28‑37℃条件下反应2‑

8h,制得10‑羟基癸酸。

13.如权利要求12所述应用,其特征在于,所述步骤(3)中,癸酸转化浓度为0.5g/L。

14.如权利要求13所述应用,其特征在于,步骤(3)中向大肠杆菌BL21 (DE3)pET21b‑CYP153A A229S‑CPRBM3静息细胞中加入癸酸至浓度为0.5g/L,在30℃条件下反应2h,制得

10‑羟基癸酸。

15.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(3)中的转化培养基组分如下:甘油按质量分数计0.8~1.2%, 葡萄糖按质量分数计0.3~0.5%,氨苄青霉素100μg/mL,余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

16.如权利要求15所述应用,其特征在于,所述步骤(3)中,转化培养基组分如下:甘油按质量分数计1%, 葡萄糖按质量分数计0.4%,氨苄抗生素100μg/mL,余量溶剂为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

17.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(3)中,转化培养条件为在29~31℃条件下培养8小时。

18.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤(3)中,癸酸溶解于二甲基亚砜。