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专利号: 2024104701451
申请人: 浙江理工大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-01
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于液态酶保护剂的植物蛋白,其特征在于,所述植物蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述植物蛋白的编码基因构建的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述植物蛋白在制备液态酶保护剂中的应用,其特征在于,所述液态酶为柠檬酸合成酶;所述保护剂为热稳定性保护剂。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述保护剂是含植物蛋白编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶液。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的应用是将纯酶液与液态酶以蛋白摩尔数0.01‑2:1混合。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述纯酶液按如下方法制备:

(1)工程菌诱导表达:将含植物蛋白编码基因的工程菌接种在LB液体培养基中,37℃过夜培养,得到预培养的菌液;取预培养的菌液以体积浓度2%的接种量接种至LB液体培养基中,37℃,260rpm培养至OD600=0.6;再加入终浓度0.4mM的IPTG,16℃,100rpm诱导12h;

(2)超声破碎:诱导后的菌液5000rpm,10min离心,去除上清;沉淀加入ddH2O重悬,

5000rpm,10min离心,去除上清;沉淀中加入蛋白裂解液重悬,在重悬液中加入100mM苯甲基磺酰氯,于冰上静置5min;在功率20W、工作4s、间隔8s的条件下超声破碎15min,至溶液澄清;13,000g,10min离心,收集上清液;蛋白裂解液:pH 7.5、50mM Tris‑Cl,0.1M KCl,10%甘油;

(3)蛋白纯化:采用Ni‑NTA重力纯化柱,步骤(2)收集的上清液上样,4℃孵育10min,通过重力作用使上清自然流出;先用1倍柱体积的Wash buffer洗脱至树脂上无明显溶液残留后,再次加入Wash buffer,重复该步骤3‑5次,洗脱非特异性结合的蛋白或杂质;采用1倍柱体积的Elution buffer,洗脱与纯化树脂特异性结合的目的蛋白,收集洗脱液;每50mL的Wash buffer组成:49mL蛋白裂解液,1mL 1M咪唑;每50mL的Elution buffer组成:37.5mL蛋白裂解液,12.5mL 1M咪唑;

(4)透析:采用截留分子量14kDa的透析袋对步骤(3)收集的洗脱液进行过夜透析,收集透析过夜后透析袋中溶液,即为纯酶液;透析液:20mM HEPES‑KOH,pH=7.5。