1.一种基于滚环转录和CRISPR‑Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组检测体系,其特征在于,包括环状双链DNA模板、T7 RNA聚合酶、Lbu Cas 13a酶和RNA荧光探针;所述环状双链DNA模板由线性单链DNA、T7启动子混合孵育形成双链DNA、再加入DNA连接酶反应形成,所述Lbu Cas 13a酶被靶标piRNA激活顺式切割和反式切割活性实现对靶标piRNA的检测;
所述线性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述靶标piRNA的基因序列如SEQ ID NO.3所示;
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
2.一种如权利要求1所述的探针组检测体系用于非诊疗目的检测piRNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、探针序列预处理:将线性单链DNA、T7启动子冻干粉溶解后稀释,在缓冲液中孵育形成双链DNA;
S2、形成环状双链DNA:将S1制备的双链DNA与T4 DNA连接酶混合反应得到环状双链DNA;
S3、滚环转录:往S2步骤得到的体系中加入 T7 RNA 聚合酶、NTP 混合液在缓冲液中均匀混合反应;
S4、Cas13a‑crRNA‑Target三元复合物的形成和荧光检测:往S3步骤得到体系中加入Lbu Cas 13a,在缓冲液中反应,再加入待测样本反应,最后加入RNA荧光探针反应,荧光分光光度计进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S1步骤中线性单链DNA与T7启动子稀释后摩尔比为1:1,所述缓冲液pH为7.8,包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇和ATP,所述孵育的温度为95℃,孵育的时间为5 min。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S2步骤中T4 DNA连接酶的浓度为
0.5U/µL,反应的温度为22℃,反应的时间为30min。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S3步骤中T7 RNA 聚合酶浓度为0.5U/µL ;所述NTP 混合液浓度为2.5mM;所述缓冲液pH为8.0,包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐和植物亚精胺;所述反应的温度均为37℃,反应的时间为1h。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S4步骤Lbu Cas 13a与RNA荧光探针的浓度比为1:10;所述缓冲液pH为8.3,包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2和KCl;所述缓冲液中反应的温度为37℃,反应的时间为20min;所述荧光分光光度计设定激发波长EX=
490nm,发射波长EM=522nm。