1.一种热稳定性高的右旋糖酐酶S326P和S326V,其中右旋糖酐酶S326P的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,右旋糖酐酶S326V的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因,其特征在于,右旋糖酐酶S326P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,右旋糖酐酶S326V的,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.包含权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V编码基因的重组载体;
优选地,包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的载体为Aodex‑pColdⅢ‑S326P,包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的载体为Aodex‑pColdⅢ‑S326V。
4.包含权利要求1所述的右旋糖酐酶S326P和右旋糖酐酶S326V的编码基因的重组菌株;优选地,包含所述右旋糖酐酶S326P编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3,Aodex‑pColdⅢ‑S326P)菌株,包含所述右旋糖酐酶S326V编码基因的重组菌株为大肠杆菌Top10(DE3,Aodex‑pColdⅢ‑S326V)菌株。
5.制备权利要求1所述的右旋糖酐酶的方法,包括对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸序列进行定点突变并进行表达,获得所述右旋糖酐酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为P,表达后获得右旋糖酐酶S326P,对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的氨基酸S突变为V,表达后获得右旋糖酐酶S326V。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)对野生型右旋糖酐酶编码基因S326位点所在的基因序列分别设计正向和反向定点突变引物,以质粒Aodex‑pColdⅢ为模板对整个质粒进行PCR扩增进行定点突变,扩增完成后加入DpnⅠ限制性内切酶对模板质粒进行消化,获得重组质粒;
2)以所述重组质粒转化至大肠杆菌Top10(DE3)菌株,获得重组菌株;
3)发酵培养所述的重组菌株,加入诱导剂表达并分离纯化右旋糖酐酶。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤1)中右旋糖酐酶S326P的正向突变引物序列如SEQ ID NO.5所示,右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.6所示;右旋糖酐酶S326V的正向突变引物序列如SEQ ID NO.7所示,右旋糖酐酶S326P的反向突变引物序列如SEQ ID NO.8所示。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤3)中诱导剂为IPTG,浓度为0.2mM。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤3)中的蛋白纯化方法为:7000rpm离心10min收集菌体,将菌体悬浮于缓冲液中,用超声细胞破碎仪对菌体进行破壁,随后
12000rpm离心30min,取上清液采用蛋白纯化仪进行分离纯化,纯化方式为镍柱亲和层析。