1.目标基因beas的敲除载体的构建,其特征在于包括以下步骤:
1)、beas基因上下游组合片段基因的获取:
从虫草菌的野生型基因组中扩增得到作为目的基因的beas基因的开放阅读框上下游片段;beas基因上游组合片段序列如SEQ ID NO:2所述,beas基因下游组合片段序列如SEQ ID NO:3所述;
2)、步骤1)所得的beas基因上游组合片段序列、beas基因下游组合片段序列与质粒pPK2‑bar‑GFP重组;重组产物转化于Eco.li DH5α感受态细胞中,得到目标基因beas的敲除载体。
2.根据权利要求1所述的目标基因beas的敲除载体质粒的构建,其特征在于所述步骤
2)为:
2.1)、将上游片段与pPK2‑bar‑GFP连接后转入Eco.li DH5α中,所得重组质粒命名为
5’‑pPK2‑bar‑GFP;
2.2)、将5’‑pPK2‑bar‑GFP与下游片段连接后转入Eco.li DH5α中,所得重组质粒命名为5’‑pPK2‑bar‑GFP‑3’;所述5’‑pPK2‑bar‑GFP‑3’为目标基因beas的敲除载体。
3.利用根癌农杆菌介导敲除蝉花虫草菌基因的方法,其特征在于包括以下步骤:一、制备重组质粒5’‑pPK2‑bar‑GFP‑3’;
二、将5’‑pPK2‑bar‑GFP‑3’转入根癌农杆菌中,得工程菌;所述工程菌进行真菌的遗传转化,得农杆菌AGL1阳性单菌落;
三、真菌活化培养:
于PDA平板上取虫草菌菌液划板活化蝉花虫草菌,制取孢子悬液;
四、工程菌活化培养:
将步骤二所得的农杆菌AGL1阳性单菌落,接种到含相应抗生素的LB液体培养基中培养到一定浓度,得到工程菌液;用含有抗生素和乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)的IMAS液体培养基中黑暗震荡培养,获取侵染液;
五、农杆菌侵染和共培养:
将所述步骤四所得的侵染液与所述步骤三所得的孢子悬液1:1混合,共培养于含相应抗生素的固体诱导培养基上,直至其长出白色绒毛状菌丝;
所述的诱导培养基:IMAS基础培养基,400mL·L‑1 2.5×MM salts,0.9g·L‑1 Glucose,10mL·L‑1 50%Glycerol,40mL·L‑1 40mM MES pH5.8,20mL·L‑1 10mM AS,
15g·L‑1 Agar;
六、分化筛选:
将步骤五中长出的白色绒毛状菌丝的转移到筛选培养基上,接着在此基础上再倒入含有相应抗生素的筛选培养基形成三明治模型,继续培养,直至其长出白色簇状绒毛;
所述的筛选培养基:M‑100基础培养基,62.5mL·L‑1 M‑100Salt solution,10g·L‑1 ‑1 ‑1Glucose,3g·L‑1 KNO3,15g·L‑1 Agar;2mL·L 200mg/mL cef,1.5mL·L 200mg/mL ppt;
七、二次筛选:
将所述步骤六长出的转化子挑取到含相应抗生素的M‑100筛选培养基上进行二次筛选,筛选出可能的阳性转化子,并将其转移到PDA培养基上,继续培养,直至长出菌株;
八:运用两步PCR验证,得到阳性突变菌株。