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专利号: 2022113355641
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-25
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌,由如下方法构建获得:

(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株,将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaRI70V和AHL合成酶esaI,在基因esaRI70V后添加终止子Tlpd,在基因esaI后添加终止子TrpoC,得到菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI;

(2)将菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为PTrc启动子,得到菌株E.coilW3110EYC::esaRI70V::esaI::cysM::nrdHΔlacI;

(3)将质粒pTrc99a‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB上的基因lacI的启动子替换为PesaS,并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签,构建得到发酵质粒pTrc99a‑PesaS‑lacI(LAA)‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB,其中LAA为降解标签,将其导入将步骤(2)所得菌株中,得到E.coilW3110::esaRI70V::esaI::PTrc‑cysM::PTrc‑nrdHΔlacI/pTrc99a‑PesaS‑lacI(LAA)‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB,即为所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的高产L‑半胱氨酸的基因工程菌,其特征在于所述转录调节因子esaRI70V的序列如SEQ ID NO.1所示,所述AHL合成酶esaI的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.构建权利要求1所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌的方法,其特征在于所述方法如下:

(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株,应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaRI70V和AHL合成酶esaI,在基因esaRI70V后添加终止子Tlpd,在基因esaI后添加终止子TrpoC,得到菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI;

(2)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为PTrc启动子,得到菌株E.coilW3110EYC::esaRI70V::esaI::cysM::nrdHΔlacI;

(3)将质粒pTrc99a‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB上的基因lacI的启动子替换为PesaS,并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签,构建得到发酵质粒pTrc99a‑PesaS‑lacI(LAA)‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB,将其导入将步骤(2)所得菌株中,得到E.coilW3110::esaRI70V::esaI::PTrc‑cysM::PTrc‑nrdHΔlacI/pTrc99a‑PesaS‑lacI(LAA)‑PTrc‑cysE‑ydeD‑serC‑cysB,即为所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述转录调节因子esaRI70V的序列如SEQ ID NO.1所示,所述AHL合成酶esaI的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述启动子PesaS的序列如SEQ ID NO.3所示,降解标签LAA的序列如SEQ ID NO.4所示,终止子TrpoC的序列如SEQ ID NO.5所示,终止子Tlpd的序列如SEQ ID NO.6所示。

6.如权利要求1所述的基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述基因工程菌接种至发酵培养基中,在26~37℃、200~800rpm条件下发酵培养60~72h,发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L‑半胱氨酸。