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专利号: 2022111772683
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除,通过基因型鉴定和选育‑/‑获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd ;所述鱼为斑马鱼;

所述利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除的具体操作包括以下步骤:在NCBI数据库中搜索或者通过PCR扩增测序获得目标鱼cntd1基因的序列,根据序列设计敲除靶点,靶点序列如SEQ ID NO.1所示,构建敲除质粒或合成敲除相关RNA,经显微注射后获得敲除F0胚胎;

‑/‑

(2)将雌性2N_cntd 与其他基因型的雄性交配,获得的子代生长至可以剪尾时,通过‑/‑/‑基因型鉴定和流式检测,筛选获得cntd1纯合敲除三倍体鱼3N_cntd ;

‑/‑/‑

(3)将雌性3N_cntd 与其他基因型的雄性交配,获得的子代生长至可以剪尾时,通过‑/‑/‑/+基因型鉴定和流式检测,筛选获得cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd ,即为遗传可控的四倍体鱼。

2. 根据权利要求1所述的选育方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述通过基因型鉴定‑/‑和选育获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd 的具体操作包括以下步骤:在敲除靶点上、下游设计检测引物,通过PCR扩增涵盖靶点的DNA片段,再检测cntd1靶点序列的变化情况,对显微注射后获得的敲除F0胚胎进行敲除效率检测,并将经检测敲除有效的F0胚胎培育至成年得到阳性F0个体;再将阳性F0个体与野生型交配得到的F1胚胎,对F1胚胎进行敲除效率检测,并将经检测敲除有效的F1胚胎培育至成年得到阳性F1个体;再将具有相同突变的阳性F1个体进行自交得到F2胚胎,对F2进行基因型鉴定,筛选获得cntd1纯合敲除个体2N_‑/‑cntd  。

3.根据权利要求1所述的选育方法,其特征在于,利用基因敲除技术对二倍体斑马鱼的cntd1基因进行敲除时,根据序列设计敲除靶点、构建敲除质粒、经显微注射后获得敲除F0胚胎的具体操作包括如下步骤:在NCBI数据中搜索获得斑马鱼cntd1的基因序列,根据Crispr/cas9靶点设计规则,在斑马鱼cntd1基因上设计敲除靶点,选取外显子中以G/GG开头、NGG结尾的18‑22 bp片段作为靶点,序列如SEQ ID NO.1所示;

将T7启动子序列、靶点序列和gRNA骨架前20个碱基合并设计为正向引物F1,序列如SEQ ID NO.2所示;将gRNA骨架末端20个碱基设计为反向引物R1,序列如SEQ ID NO.3所示;

以含有gRNA 骨架的质粒为模板,利用所述正向引物F1、反向引物R1进行PCR扩增,得到gDNA;以gDNA为模板,进行体外转录,得到gRNA;用XbaI内切酶线性化pT3.Cas9‑UTRglobin质粒,再以线性化的质粒为模板,经体外转录合成Cas9 mRNA;进行显微注射,获得敲除F0斑马鱼胚胎。

4. 根据权利要求1所述的选育方法,其特征在于,通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体斑马鱼时,在敲除靶点上、下游设计的检测引物为cntdF/cntdR,所述cntdF的引物序列如SEQ ID NO.4所示,所述cntdR的引物序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1所述的选育方法,其特征在于,对显微注射后获得的敲除斑马鱼F0胚胎进行敲除效率检测时,敲除效率检测的具体包括如下步骤:利用检测引物对F0胚胎的cntd1基因进行PCR扩增,进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况,对敲除效率进行检测;

当检测出的cntd1基因峰图将在靶点附近出现套峰,并且套峰现象延续至序列末端时,即为敲除有效的F0胚胎;

对斑马鱼F1胚胎进行敲除效率检测时,敲除效率检测的具体包括如下步骤:利用检测引物对F1胚胎的cntd1基因进行PCR扩增,进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况,对敲除效率进行检测;当检测出的cntd1基因峰图在靶点附近出现双峰,对照野生型斑马鱼cntd1基因序列在双峰位点排除野生型,得到非三倍数的插入/缺失改变的F1胚胎,即为敲除有效的F1胚胎。

6. 根据权利要求1所述的选育方法,其特征在于,对F2进行基因型鉴定的具体操作包括以下步骤:当F2群体达到2月龄后,剪取尾鳍进行基因型鉴定,利用筛选引物cntdF/cntdR2进行PCR扩增,所述cntdF的引物序列如SEQ ID NO.4所示,所述cntdR2的引物序列如SEQ ID NO.6所示;得到的PCR产物经BamHI酶切检测,获得F2群体的cntd1基因型,其中测序结果显示单一峰的个体为野生型或纯合子,通过跟数据库中的野生型cntd1序列进行比对‑/‑排除野生型,筛选得到的纯合子即为2N_cntd 斑马鱼。

7.根据权利要求1‑6中任一项所述的选育方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述其他基因型的雄性为杂合子或纯合子雄鱼;在步骤(3)中,所述其他基因型的雄性为野生型或杂合子雄鱼。

8.一种遗传可控的三倍体鱼的制备方法,其特征在于,利用权利要求1‑7中任一项所述‑/‑/‑/+选育方法选育得到的cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd 与异性野生型二倍体进行交配,得到的三倍体鱼。