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专利号: 2022111623369
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-11-04
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.)的重组酯酶,其特征在于,所述重组酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因。

3.一种含权利要求2所述重组酯酶编码基因的重组质粒。

4.一种由权利要求3所述重组质粒转化获得的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组酯酶在水解(R,S)‑酮洛芬乙酯生成R‑酮洛芬中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的应用为:将含重组酯酶编码基因的工程菌经诱导发酵得到的湿菌体用缓冲液重悬后超声破碎提取的纯酶液为催化剂,以(R,S)‑酮洛芬乙酯为底物,以pH7.0‑9.0的缓冲溶液为反应介质构成反应体系,在20~60℃、120~

240rpm条件下进行水解拆分反应,获得R‑酮洛芬。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述反应介质为pH8.0、50mM的Tris‑HCl的缓冲溶液;所述底物加入量以反应体系总体积计为0.5‑35g/L;所述催化剂用量以蛋白含量计为0.16‑0.9mg/L。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述催化剂按如下方法制备:(1)将湿菌体用冰预冷的pH8、50mM的Tris‑HCl缓冲液重悬,获得菌悬液;菌悬液在0‑4℃、350‑450W条件下超声破碎10‑15min,超声破碎期间工作2s、间歇3s;将获得的破碎液在4℃、8000rpm离心

10min,收集上清液;(2)步骤(1)上清液上样经含10mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液平衡的Ni‑NTA亲和层析柱,以1mL/min的速度上样,上样结束后,先用含20mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液冲洗柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线,再用含250mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液一步法洗脱目的蛋白,收集含有目的蛋白的洗脱液,透析、浓缩,获得重组酯酶的纯酶液。

9.如权利要求6或8所述的应用,其特征在于,所述的湿菌体按以下步骤获得:将含有重组酯酶编码基因的工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃,

200rpm的摇床中培养12‑16h,获得种子液;再将种子液按照体积浓度为1%的接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6‑0.8,加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG,置于25℃摇床中200rpm诱导发酵10‑12h,发酵液经离心,沉淀即为湿菌体。