1.一种源自伯克霍尔德氏杆菌(P.graminis)的腈水解酶PgNit在选择性催化6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸中的应用,其特征在于,所述腈水解酶PgNit氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的应用为:以含腈水解酶PgNit基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂,以6‑氯烟腈和2‑氯烟腈为底物,以pH 6.0‑9.0的缓冲液为反应介质,在25‑40℃条件下进行反应,获得含6‑氯烟酸和2‑氯烟酰胺的反应液。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计,所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2‑20g/L;所述6‑氯烟腈和2‑氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100‑500g/L。
4.一种用于权利要求1所述选择性催化6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸的腈水解酶突变体PgNit‑A55S,其特征在于,所述腈水解酶突变体PgNit‑A55S是将SEQ ID NO.2所示氨基酸的第55位的丙氨酸突变为丝氨酸获得的。
5.一种含权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit‑A55S的编码基因的重组基因工程菌。
6.如权利要求5所述的重组基因工程菌,其特征在于,所述重组基因工程菌是将目的基因插入质粒pET28b(+)上的NcoI和XhoI之间,转化于E.coli BL21(DE3)宿主细胞中获得的。
7.一种权利要求4所述腈水解酶突变体PgNit‑A55S在选择性催化6‑氯烟腈合成6‑氯烟酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的应用为:以含腈水解酶突变体PgNit‑A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂,以6‑氯烟腈和2‑氯烟腈为底物,以pH 6.0‑9.0的缓冲液为反应介质,在25‑40℃条件下进行反应,获得含6‑氯烟酸的反应液。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计,所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2‑20g/L;所述6‑氯烟腈和2‑氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100‑500g/L。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述含腈水解酶突变体PgNit‑A55S基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液按如下方法制备:
1)平板培养:将含腈水解酶突变体PgNit‑A55S基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基,经37℃过夜活化,获得单菌落;所述LB固体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂15g/L,溶剂为水,pH 7.0;
2)种子培养:将单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,180rpm培养10‑12h,获得种子液;所述LB液体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为水,pH 7.0;
3)发酵培养:将种子液以体积浓度2%的量接种至含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基,于37℃,180rpm条件下培养至OD600为0.6‑0.8,加入终浓度为0.1mM的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷,于28℃,180rpm条件下诱导培养10‑12h,菌液在8000rpm,4℃下离心,收集湿菌体;
4)湿菌体破碎:将湿菌体悬浮于pH5.0~9.0的缓冲液,置于超声破碎仪中,10‑50kHz频率下破碎5‑30min,收集破碎混合液,即获得粗酶液。