1.一种免疫磁性增强检测丝素蛋白的方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:将CuCl2·2H2O溶解于含有PEG的水中,得到混合溶液,超声分散均匀;另行将NaOH溶解于PEG和水的混合溶液中,超声分散均匀;将两种混合溶液混合使其反应得到CuO溶液,进一步超声处理,加过量乙醇静置;用无水乙醇和水轮番清洗生成物,并用AgNO3溶液‑1滴定,直至Cl 完全清除;后对生成物离心分离,将产物保温,再研磨成粉体,高温煅烧后得到纳米CuO;步骤2:称取FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O溶解于水中,在充氮气保护下搅拌至溶解;加入NaOH,水浴加热持续搅拌,制得Fe3O4磁性纳米颗粒;称取Fe3O4磁性纳米颗粒于容器中,加入浓硝酸,超声处理,随后水洗,加入无水乙醇,水及氨水后超声处理,取出,搅拌下缓慢滴加TEOS,持续搅拌,随后先后用乙醇和水洗涤,真空干燥,得到纳米磁珠,将其于磷酸盐缓冲溶液中保存;
步骤3:取纳米磁珠于容器中,加入水,超声分散均匀,再加入氯仿,无水乙醇,然后加入丙烯酰胺,乙腈和甲基丙烯酸,室温下快速搅拌,充分混匀后,加入引发剂偶氮二异丁腈,快速搅拌反应,利用外磁场进行固液分离,用无水乙醇和水反复洗涤,直至洗去多余的有机物,得到功能化纳米磁珠微粒,置于350‑450uLPBS中,得到功能化纳米磁珠分散液;
步骤4:取功能化纳米磁珠分散液于离心管中,利用磷酸盐缓冲溶液洗涤,重新分散于磷酸盐缓冲溶液中;向所得分散液中加入EDC/NHS混合溶液,室温震荡活化反应,用磷酸盐缓冲溶液洗涤,分散于磷酸盐缓冲液中,加入丝素蛋白抗体震荡处理后加入Tris‑BSA,震荡后洗涤,得到特异性磁珠,分散于磷酸盐缓冲液中;
步骤5:取步骤1所得纳米CuO于PBS中超声处理,加入丝素蛋白抗体,震荡处理,将所得产物冷冻离心后移去上层清液,分散于PBS中,再冷冻离心后移去下层底物,加入BSA溶液,混匀反应,得到特异性纳米CuO;
步骤6:将所得特异性磁珠和特异性纳米CuO加入到待检测的丝素蛋白溶液中,震荡孵育,离心后移去上清液,置于双氧水中,将所得氧气通入压力传感器。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1具体为:将CuCl2·2H2O溶解于含有0.5‑
1.5wt%的水中,CuCl2浓度为0.5‑1.5wt%,得到混合溶液,超声分散均匀;另行将NaOH溶解于含有0.5‑1.5wt%PEG的水中,得到混合溶液中, NaOH浓度为8‑12mg/mL,超声分散均匀;将两种混合溶液混合后进一步超声处理,加过量乙醇静置过夜;用无水乙醇和水轮番清洗生成‑1物,并用AgNO3溶液滴定,直至Cl 完全清除;后对生成物离心分离,将产物90‑100℃保温10‑
20h,再研磨成粉体,350‑450℃高温煅烧后得到纳米CuO。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2具体为:称取5‑6g FeCl3·6H2O和2‑4g FeSO4·7H2O溶解于100mL水中,在充氮气保护下搅拌至溶解;加入3‑5g NaOH,70‑90℃水浴持续搅拌0.5‑1.5h,制得Fe3O4磁性纳米颗粒;称取180‑220mg Fe3O4磁性纳米颗粒于容器中,加入15‑20mL浓硝酸,超声10‑30min,随后水洗,加入15‑25mL无水乙醇,35‑45mL水及3‑
5mL氨水后超声处理10‑30min,取出,搅拌下缓慢滴加3‑4mL TEOS,持续搅拌3‑5h,随后先后用乙醇和水洗涤,55‑65℃下真空干燥1‑3h,得到纳米磁珠,将其于磷酸盐缓冲溶液中保存。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3具体为:取0.3‑0.5g纳米磁珠于容器中,加入15‑25mL水,超声分散均匀,再加入8‑12mL氯仿,2‑3mL无水乙醇,然后加入0.3‑0.7g丙烯酰胺,0.8‑1.2mL乙腈和2‑3mL甲基丙烯酸,室温下快速搅拌10‑30min,充分混匀后,加入0.08‑0.12g引发剂偶氮二异丁腈,在40‑50℃下快速搅拌反应6‑8h,利用外磁场进行固液分离,用无水乙醇和水反复洗涤,直至洗去多余的有机物,得到功能化纳米磁珠微粒,置于
350‑450uLPBS中,得到功能化纳米磁珠分散液。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4具体为:取80‑120uL功能化纳米磁珠分散液于离心管中,利用磷酸盐缓冲溶液洗涤,重新分散于350‑450uL磷酸盐缓冲溶液中;向所得分散液中加入250‑350uL的EDC/NHS混合溶液,室温震荡活化反应0.5‑1.5h,用磷酸盐缓冲溶液洗涤,分散于400‑600uL磷酸盐缓冲液中,加入8‑12uL丝素蛋白抗体,25‑30℃震荡
0.5‑1.5h后加入80‑120uL Tris‑BSA,震荡0.5‑1.5h后洗涤,得到特异性磁珠,分散于300‑
500uL磷酸盐缓冲液中。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤4中,磷酸盐缓冲溶液pH为7.4,EDC/NHS混合溶液中MES、NaCl、EDC、NHS的用量比为(0.3‑0.5)g:(0.4‑0.6)g:(15‑25)mg:(20‑30)mg。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5具体为:取0.8‑1.2mg步骤1所得纳米CuO于0.8‑1.2mL PBS中超声处理0.5‑1.5h,加入80‑120uL丝素蛋白抗体,震荡3‑5h,将所得产物冷冻离心后移去上层清液,分散于0.8‑1.2mL PBS中,再冷冻离心后移去下层底物,加入300‑500uL 2‑4wt%的BSA溶液,混匀反应20‑40min,得到特异性纳米CuO。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6具体为:将所得特异性磁珠和特异性纳米CuO加入到待检测的丝素蛋白溶液中,在30‑40℃条件下震荡孵育1‑3h,离心后移去上清液,置于双氧水中,将所得氧气通入压力传感器。