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专利号: 2022105076622
申请人: 辽宁大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种耐热性纳豆激酶重组基因工程菌,其特征在于,所述耐热性纳豆激酶重组基因工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)LNUB571,保藏编号为:CGMCC No.24107。

2.一种耐热性纳豆激酶重组基因工程菌的构建方法,其特征在于,构建方法包括如下步骤:

1)以枯草芽孢杆菌DNA为模板,以Primer 1和Primer 2为引物,通过PCR反应,获得两端添加酶切位点EcoR I和Xho I的纳豆激酶前导肽‑成熟肽基因片段NKt;

Primer 1:CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGCPrimer 2:GCGGAATTCGCTGGTAAGTCCTCCACCG

2)构建重组表达载体PGEX‑6P‑NKY256P:以基因片段NKt DNA为模板,以Primer 3和Primer 4,Primer 5和Primer 6为引物,通过重叠延伸PCR反应,获得突变的NKY256P基因片段;将突变的NKY256P基因片段和PGEX‑6P‑1载体进行双酶切连接,获得重组表达载体PGEX‑

6P‑NKY256P;

Primer 3:CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGCPrimer 4:TAGAAGGAGTTACCCAGTGGGGTTGCAGTGGATTCCAATCTPrimer 5:CCACTGGGTAACTCCTTCTACTACGGTAAGGGTTTGATCAAPrimer 6:GCGGAATTCGCTGGTAAGTCCTCCACCG

3)转化:将重组表达载体PGEX‑6P‑NKY256P转化到大肠杆菌BL21中,获得重组基因工程菌,为耐热性纳豆激酶重组基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤1)中,PCR反应的条件为:PCR反应条件:98℃预变性2min;98℃10s,55℃30s,72℃30s,72℃延伸7min,25cycles;

4℃10min。

4.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤2)中,重叠延伸PCR反应的条件为:PCR反应条件:98℃预变性2min;98℃10s,55℃30s,72℃30s,72℃延伸7min,25cycles;

4℃10min。

5.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤1)中,所述基因片段NKt的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤2)中,所述NKY256P基因片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

7.权利要求1所述的一种耐热性纳豆激酶重组基因工程菌在表达纳豆激酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,表达方法如下:筛选耐热性纳豆激酶重组基因工程菌的阳性菌落,接种于含Ampicillin的LB液体培养基中,37℃,180rpm/min,摇床培养14‑16h,收集菌液;将收集到的菌液进行离心处理,离心条件为4℃,20min,离心结束后,弃上清液,收集菌体沉淀;PBS缓冲液稀释菌体沉淀,功率25w,开2s,关3s,进行细胞破碎,破碎20min后,冷冻离心收集蛋白上清液,得到纳豆激酶蛋白,命名为纳豆激酶蛋白RNKT2。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述纳豆激酶蛋白RNKT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

10.权利要求1所述的一种耐热性纳豆激酶重组基因工程菌在制备纳豆激酶蛋白中的应用。