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专利号: 2022104241552
申请人: 南京师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-08-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种产萜类化合物的重组菌株,所述萜类化合物为α‑葎草烯或者角鲨烯,其特征在于,该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得,相比于所述出发菌株,所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α‑葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量,或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量;

其中,所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体,所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的α‑葎草烯合酶的基因,或者分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的角鲨烯合酶的基因。

2.根据权利要求1所述的产萜类化合物的重组菌株,其特征在于,所述α‑葎草烯合酶的编码基因ACHS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求2所述的产萜类化合物的重组菌株,其特征在于,所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中α‑葎草烯合酶的活性增强时,将所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9替换为铜离子抑制型启动子CTR2;其中,所述铜离子抑制型启动子CTR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的产萜类化合物的重组菌株,其特征在于,所述重组菌株的细胞质中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因tHMG1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因ERG20、甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12、羟甲基戊二酰‑CoA合酶的编码基因ERG13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19、乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因IDI中的至少一种;所述重组菌株的过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI中的至少一种;其中,所述编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6‑13所示;和/或,所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶A的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入CoA‑乙酰化醛脱氢酶的编码基因AAD、醛脱氢酶的编码基因ALDH、肉碱乙酰转移酶的编码基因Cat2、AMP脱氨酶的编码基因AMPD、ATP柠檬酸裂解酶的编码基因ACL1、ACL2、磷酸酮醇酶的编码基因PK和磷酸转乙酰酶的编码基因PTA中的至少一种;其中,所述编码基因AAD、ALDH、Cat2、AMPD、ACL1、PK、PTA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14‑20所示,所述编码基因ACL2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29所示;

所述重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶A的通量增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中过表达3‑酮酰基‑CoA硫解酶的编码基因POT1、过氧化物酶体多功能酶I型的编码基因MEF1、过氧化物酶体生物发生因子10的编码基因PEX10中的至少一种和/或敲除过氧化物酶体苹果酸合酶的编码基因MIS1和过氧化物酶体柠檬酸合酶的编码基因CIT2中的至少一种;其中,所述编码基因POT1、MEF1、PEX10、MIS1和CIT2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:21‑25所示;和/或,所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还通过外源引入关键限速酶的编码基因NADH‑tHMG1,编码基因NADH‑tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的产萜类化合物的重组菌株,其特征在于,所述出发菌株为敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌,所述编码基因ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示;和/或,所述重组菌株的保藏编号为CGMCC No.24525。

6.一种构建重组菌株的方法,其特征在于,该方法包括:对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别增强α‑葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量,或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量;

其中,所述增强α‑葎草烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的α‑葎草烯合酶的基因,所述增强角鲨烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的角鲨烯合酶的基因。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述α‑葎草烯合酶的编码基因ACHS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;和/或,所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中α‑葎草烯合酶的活性增强时,将所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9替换为铜离子抑制型启动子CTR2;其中,所述铜离子抑制型启动子CTR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;和/或,所述出发菌株为敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌,所述编码基因ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。

8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述细胞质中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因tHMG1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因ERG20、甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12、羟甲基戊二酰‑CoA合酶的编码基因ERG13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19、乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因IDI中的至少一种;所述过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI中的至少一种;其中,所述编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6‑13所示;和/或,所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶A的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入CoA‑乙酰化醛脱氢酶的编码基因AAD、醛脱氢酶的编码基因ALDH、肉碱乙酰转移酶的编码基因Cat2、AMP脱氨酶的编码基因AMPD、ATP柠檬酸裂解酶的编码基因ACL1、ACL2、磷酸酮醇酶的编码基因PK和磷酸转乙酰酶的编码基因PTA中的至少一种;其中,所述编码基因AAD、ALDH、Cat2、AMPD、ACL1、PK、PTA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14‑20所示,所述编码基因ACL2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29所示;

所述重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶A的通量增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中过表达3‑酮酰基‑CoA硫解酶的编码基因POT1、过氧化物酶体多功能酶I型的编码基因MEF1、过氧化物酶体生物发生因子10的编码基因PEX10中的至少一种和/或敲除过氧化物酶体苹果酸合酶的编码基因MIS1和过氧化物酶体柠檬酸合酶的编码基因CIT2中的至少一种;其中,所述编码基因POT1、MEF1、PEX10、MIS1和CIT2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:21‑25所示;和/或,所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还通过外源引入关键限速酶的编码基因NADH‑tHMG1,编码基因NADH‑tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

9.一种发酵产萜类化合物的方法,所述萜类化合物为α‑葎草烯或者角鲨烯,其特征在于,该方法包括:将权利要求1至5中任意一项所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵;

或者,按照权利要求6至8中任意一项所述的方法构建重组菌株,并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。

10.权利要求1至5中任意一项所述的重组菌株或权利要求6‑8中任意一项所述的方法在制备萜类化合物中的应用,其中,所述萜类化合物为α‑葎草烯或者角鲨烯。