1.一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3及CYP71AM1；

b、通过同源重组的方式将DES2基因和DES3基因分别构建至真核表达载体pESC‑His的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS1基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC‑Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS2基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC‑Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将CYP71AM1基因和来源于拟南芥的ATR1基因分别构建至真核表达载体pESC‑Leu的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1；

c、将pESC‑His‑DES2‑DES3质粒、pESC‑Ura‑ARS1‑OMT3或pESC‑Ura‑ARS2‑OMT3、和pESC‑Leu‑CYP71AM1‑CPR利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母BY4741，涂布于Sc‑His‑Leu‑Ura筛选平板，28 32℃下培养2 4 d；长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于Sc‑His‑Leu‑~ ~

Ura液体筛选培养基，在摇床中，28 32 ℃，200 250 rpm培养；取培养好的菌液，用引物~ ~

Gal1‑F/R和Gal10‑F/R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物中是否包含所有目的条带；将包含所有目的条带的菌株命名为BY‑ZJUT‑ZH1，加入甘油，冻存；

d、将菌BY‑ZJUT‑ZH1在Sc‑His‑Leu‑Ura筛选平板上划线，28 32℃培养2 4 d，挑取平板~ ~

上的重组酿酒酵母单菌落到培养基中，在摇床中28 32 ℃，180  220rpm过夜；将菌体转移~ ~

到新的培养基中，使其初始OD600=0.5，继续在28~32 ℃，180 ~220rpm摇床中培养18~26 h；

然后用无菌离心管在（2000 4000）g离心2 10 min收集菌体，并转移至YPG培养基中，在28~ ~ ~

32℃，180  220 rpm摇床中培养40 55h；外加脂肪酸培养时，以0.05 0.2%（v/v）的终浓度加~ ~ ~

入；

f、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行产物的提取和检测。

2.一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3、P450、ATR1；

b、将DES2和DES3、A1O和OMT3、P450和ATR1两两分组分别构建到pESC系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物TADH1和TCYC1，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pESC‑URA 载体上用引物URA‑F和URA‑R扩增获得尿嘧啶URA3编码序列的表达盒片段4；合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段L1‑L4，通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得URA‑L1、L1‑ DES2‑ DES3‑L2、L2‑ A1O‑OMT3‑L3、L3‑ P450‑ATR1‑L4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点YPRC∆15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1‑URA‑L1和L4‑ site2；

将site1‑URA‑L1、L1‑ DES2‑ DES3‑L2、L2‑ A1O‑OMT3‑L3、L3‑ P450‑ATR1‑L4和L4‑ site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母CEN.PK2‑1C中，使用SD‑URA固体缺陷培养基培养2 3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌，得到BY‑ZJUT‑~

ZH2菌株；

c、将保存的甘油菌BY‑ZJUT‑ZH2菌株在平板上划线，28 32℃培养2 4 d；长出单菌落~ ~

后，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床中，28 32℃，200 250 rpm培养8 15 h；培养好的种~ ~ ~

子液继续扩大培养至200 mL，接种初始OD600为0.03~0.06，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养8 16h；

~

d、将培养好的二级种子液接种至发酵罐进行发酵，培养温度为28 32 ℃，初始搅拌转~

速为600 1000 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，pH通过补~

加氨水控制在5.6左右；本步骤培养基组成为：4~6 g/L （NH4） 2SO4，2~4g/L KH2PO4，0.03~

0.07 g/L MgSO4，50~70 mg/L尿嘧啶，50~70mg/L色氨酸，10~30 g/L葡萄糖以及本领域常规使用量的金属元素和维生素溶液；

e、培养4~6 h后，补加培养基13~16 g/L （NH4）2SO4，8~10 g/L KH2PO4，1.2~1.8 g/L MgSO4，160~200 mg/L尿嘧啶，160~200 mg/L色氨酸，50~70g/L葡萄糖，以及步骤C中三倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养；

f、继续培养4~6 h后，补加培养基23~28 g/L （NH4）2SO4，12~18 g/L KH2PO4，2.~3 g/L MgSO4·7H2O，250 ~350mg/L尿嘧啶，250 ~350 mg/L色氨酸，80~120 g/L半乳糖以及步骤C中五倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养18 30 h；

~

g、培养结束后，通过离心收集菌体，进行产物的提取和检测。