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专利号: 2022101717622
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-07-12
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株,其特征在于:所述菌株是通过原生质体融合育种技术,结合迭代筛选及验证后获得,命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLH507,菌株已于2021年11月12日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏编号为CGMCC NO.23786;该菌株同时具备水解寡糖、对木质纤维素水解液中所含混合抑制物的耐受性及代谢木糖三重特性,且具有遗传稳定性。

2.权利要求1所述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株的构建方法,步骤是:(1)通过检测海藻糖含量及总还原力指标,确定选择高鲁棒性的二倍体酿酒酵母工业菌株RC212;

(2)通过同源重组分别在菌株RC212染色体上多拷贝整合β‑葡萄糖苷酶基因和β‑木糖苷酶基因,使其获得水解纤维二糖和木寡糖的能力,所得菌株命名为BLN26,做为原生质体融合亲本1;

(3)选择保藏号为CGMCC No.11331的含有木糖异构酶基因且能代谢木糖的的重组酿酒酵母菌株LF1作为原生质体融合亲本2,进行原生质体制备后将亲本1与亲本2融合,初筛及复筛后获得潜在融合子;

(4)具三价性能稳定融合菌株的筛选:

1)将步骤(3)得到的融合子,稀释后均匀涂布于含有苯菌灵的YPXO固体筛选培养基上,

30℃恒温摇床培养3‑5天;其中,所述含有苯菌灵的YPXO固体筛选培养基是指YPXO培养基中‑1含有30ng/uL苯菌灵,YPXO培养基配方是:YP培养基添加20g·L 低聚木糖;

‑1

2)挑取生长较好的单菌落,至含1.5×混合抑制物及10ng·μL 苯菌灵的YPX液体培养基中,于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中培养3‑4天,挑取生长较好的孔板对应的菌落进行PCR及发酵性能验证;其中,所述培养基中,各抑制物组份及终浓度分别为15mM乙酸,

7.5mM甲酸,7.5mM乙酰丙酸,7.5mM糠醛,7.5mM HMF,7.5mM香草醛;YPX液体培养基配方是:‑1

YP培养基添加20g·L 木糖;

3)通过酵母菌落PCR验证,选择同时具有木糖异构酶基因、β‑葡萄糖苷酶基因和β‑木糖苷酶基因三种特征基因的单菌落;并通过摇瓶发酵验证其木糖、寡糖代谢能力;

4)再重复步骤1)至3)所述苯菌灵筛选及验证工作,直至筛选获得具三价性能的稳定融合菌株即为高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株。

3.权利要求1所述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株在以木质纤维素水解液为原料发酵生产乙醇中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述以木质纤维素水解液为原料摇瓶发酵生产乙醇的方法是:‑1 ‑1 ‑1 ‑1

在YP液体培养基中添加80g·L 葡萄糖、40g·L 木糖、10g·L 纤维二糖和10g·L 低聚木糖模拟木质纤维素水解液中的糖份组成,添加1.5×混合抑制物来模拟木质纤维素水解液中存在的多种抑制物,制成模拟木质纤维素水解液培养基;其中所述培养基中各抑制物组份及终浓度分别为15mM乙酸,7.5mM甲酸,7.5mM乙酰丙酸,7.5mM糠醛,7.5mM HMF,

7.5mM香草醛;以0.5g/L细胞干重的量将经活化及扩培后的酿酒酵母菌株BLH507接种至模拟木质纤维素水解液培养基中限氧摇瓶发酵,发酵条件是:培养温度为28‑30℃,150mL限氧瓶中装有40mL培养基,摇床转速为180‑200rpm,橡胶塞封口,插上注射器针头控制限氧条件;所述酿酒酵母菌株BLH507限氧条件培养64±2小时能将几乎全部糖份利用完并生成乙醇,基于总糖消耗的得率为0.442,糖醇转化率为理论值的87%。

5.一种适于权利要求1所述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株发酵生产乙醇的发酵培养基,其特征在于,所述发酵培养基是在YP液体培养基中添加‑1 ‑1 ‑1 ‑1

80g·L 葡萄糖、40g·L 木糖、10g·L 纤维二糖和10g·L 低聚木糖,再添加1.5×混合抑制物制得;其中所述发酵培养基中各抑制物组份及终浓度分别为15mM乙酸,7.5mM甲酸,

7.5mM乙酰丙酸,7.5mM糠醛,7.5mM HMF,7.5mM香草醛。