1.一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型,其特征在于,其构建方法包括如下步骤:
(1)Bi2O3纳米材料的制备:制备Bi2O3纳米材料;
(2)Bi2O3/ITO电极的制备:将Bi2O3纳米材料结合到ITO电极表面制得Bi2O3/ITO电极;
(3)不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备:a磷酸化反应:将序列如SEQ ID NO:1的发夹DNA加入含有不同浓度T4多聚核苷酸激酶的缓冲液中进行磷酸化反应;
b剪切反应:加入λ核酸外切酶进行剪切;
c连接反应:加入序列如SEQ ID NO:2的锁式探针DNA,在DNA连接酶存在下进行连接反应;
d滚环扩增反应:加入DNA聚合酶进行滚环扩增,获得不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液;
(4)光电流的测定:采用步骤(2)制备的Bi2O3/ITO电极测定步骤(3)中制备的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的光电流值;
(5)线性模型构建:根据步骤(4)测定的光电流值和不同T4多聚核苷酸激酶浓度之间的对应关系进行线性模型的构建。
2.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(1)中Bi2O3纳米材料的制备,包括以下步骤:
将可溶性铋盐溶解在去离子水中,然后加入柠檬酸三钠,尿素和聚乙烯吡咯烷酮,水热反应后干燥,获得Bi2O3纳米材料的粉末样品。
3.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(2)中Bi2O3/ITO电极的制备,包括以下步骤:将步骤(1)获得的Bi2O3纳米材料分散在去离子水中,制成悬浊液;然后将所得悬浊液滴涂到ITO电极表面,干燥,制得Bi2O3/ITO电极。
4.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(4)中光电流的测定,包括以下步骤:
在步骤(3)获得的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液中加入银离子溶液,并在室温下孵育;之后加入铁氰化钾溶液,继续反应;随后将步骤(2)所得Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液并反应;最后,将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用缓冲溶液洗涤后在光电化学测试系统上进行光电流的测定,得到不同已知浓度的T4多聚核苷酸激酶的光电流值。
5.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(5)中线性模型构建,包括以下步骤:
通过步骤(4)所得的不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的光电流值I,和T4多聚核苷酸激酶浓度为0的样品所得的光电流值I0,计算得到不同浓度相应的光电流差值I‑I0;然后利用不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的对数值和相应光电流的差值构建线性模型。
6.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的a磷酸化反应,包括以下步骤:
将序列为SEQ ID NO:1的发夹DNA,与不同浓度的T4多聚核苷酸激酶、三磷酸腺苷、T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液混合,孵育以实现磷酸化反应。
7.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的b剪切反应,包括以下步骤:
在a磷酸化反应的反应产物中加入λ核酸外切酶与相应的λ核酸外切酶反应缓冲液,继续孵育反应实现对磷酸化之后的发夹DNA的剪切反应。
8.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的d滚环扩增反应,包括以下步骤:
在c连接反应的反应液中加入T4 DNA连接酶与T4 DNA连接酶反应缓冲液进行连接反应;反应完成后加入phi 29DNA聚合酶和phi 29DNA聚合酶反应缓冲液以及dNTPs,室温下反应以实现滚环扩增反应,最后升温终止滚环扩增反应。
9.一种权利要求1‑8任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的应用,其特征在于,应用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶。
10.一种T4多聚核苷酸激酶的检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1‑8任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型。