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专利号: 2018110811059
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法,其特征是,该方法包括:靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时,供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链,RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。

2.如权利要求1所述的方法,其特征是:具体的,靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时,催化

5'羟化的供体RNA的磷酸化以产生5'磷酸化的供体RNA,其可以与3'羟化受体RNA连接以形成完整的RNA触发链;RNA触发链与Taqman探针完全互补,形成RNA触发剂/Taqman探针双链体杂交体,Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)特异性割,Taqman探针两端的荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号,释放的RNA触发链可结合新的Taqman探针,开始新一轮切割,循环放大信号;当不存在多核苷酸激酶(PNK)时,5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接,不能切割DNA Taqman探针释放荧光基团,因此不能检测到荧光信号。

3.如权利要求1所述的方法,其特征是,具体的包括以下步骤:

1)制作标准曲线:

将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和供体RNA混合,再分别加入不同质量的多核苷酸激酶,混合均匀进行磷酸化反应,灭活;

灭活后,加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应;

连接反应结束后,加入双链特异性核酸酶(DSN)进行特异性切割反应,反应结束后,测定荧光光谱,得到不同浓度的多核苷酸激酶样品对应的荧光光谱图;

根据不同浓度的多核苷酸激酶样品荧光光谱图在520nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线;

2)取待检测样品,按照步骤1)中的方法进行荧光检测,根据标准曲线得到待检测样品中多核苷酸激酶的浓度。

4.如权利要求3所述的方法,其特征是,磷酸化反应的条件为:35~40℃反应10~60分钟;

进一步的,连接反应的条件为:35~40℃反应40~90分钟;

进一步的,特异性切割反应条件为:50~60℃反应10~60分钟。

5.一种用于筛选或鉴定多核苷酸激酶抑制剂的方法,其特征是,该方法包括:靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时,供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链,RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。

6.采用权利要求5所述的方法筛选或鉴定的多核苷酸激酶抑制剂。

7.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的试剂盒,其特征是,至少包括以下成分:供体RNA、受体RNA、Taqman探针和双链特异性核酸酶。

8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征是:还包括1×双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水。

9.权利要求7或8所述的试剂盒在检测多核苷酸激酶中的应用。

10.权利要求7或8所述的试剂盒在多核苷酸激酶活性抑制性检测中的应用。