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专利号: 2021110220224
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种辅酶自足型大肠杆菌,由如下方法构建获得:

(1)构建表达载体,将NADH激酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、草铵膦脱氢酶基因以及NADP辅酶合成途径的基因转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,筛选正确的转化子,得到草铵膦脱氢酶‑葡萄糖脱氢酶‑NADH激酶共表达基因工程菌;所述NADH激酶基因序列如SEQ ID No.3所示,所述葡萄糖脱氢酶基因序列如SEQ ID No.6所示,所述草铵膦脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.7所示,所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8所示;

(2)敲除共表达基因工程菌基因组中mazG和nadR基因,得到所述辅酶自足型大肠杆菌。

2.构建权利要求1所述辅酶自足型大肠杆菌的方法,所述方法包括:

(1)构建表达载体,将NADH激酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、草铵膦脱氢酶基因以及NADP辅酶合成途径的基因转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,筛选正确的转化子,得到草铵膦脱氢酶‑葡萄糖脱氢酶‑NADH激酶共表达基因工程菌;所述NADH激酶基因序列如SEQ ID No.3所示,所述葡萄糖脱氢酶基因序列如SEQ ID No.6所示,所述草铵膦脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.7所示,所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8所示;

(2)敲除共表达基因工程菌基因组中mazG和nadR基因,得到所述辅酶自足型大肠杆菌。

3.权利要求1所述辅酶自足型大肠杆菌在制备L‑草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用为:以所述辅酶自足型大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的酶液为催化剂,以2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸为底物,加入硫酸铵和葡萄糖,以pH值为7.5的缓冲液为反应介质构成反应体系,在35℃ 40℃、500 600rpm条件下反应,反应结束后反应液分离纯化,获得L‑草铵膦。

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5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述反应体系中,催化剂用量以湿菌体总重量计为10~50g/L,底物的初始浓度为10~500mM,葡萄糖添加量为12 750mM,硫酸铵添加量~为50mM 1.5M。

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6.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述反应体系中,催化剂用量以湿菌体总重量计为15g/L,底物的初始浓度为200mM,葡萄糖添加量为250mM,硫酸铵添加量为300mM。