1.一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽,其特征在于:该抗冻多的分子量在1107.54~
1554.72Da,所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。
2.根据权利要求1所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)采用草鱼鱼鳞为原料,先对草鱼鱼鳞进行处理;
(2)对处理后的草鱼鱼鳞进行酶解;
(3)分离纯化酶解液;
(4)冷冻干燥后得到所述的抗冻多肽;
(5)对抗冻多肽的抗冻活性进行测定,确定最佳酶解条件;
(6)测定抗冻多肽的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:步骤(1)的具体操作过程为:将草鱼鱼鳞清洗、晒干后进行粉碎,并进行45°C超声清洗50分钟;之后将洗净的鱼鳞过滤干净,使用1mol/L的柠檬酸溶液震荡浸泡24h,最后将鱼鳞过滤清洗至中性后备用。
4.根据权利要求3所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:步骤(2)的具体操作过程为:酶购自Sigma 生物试剂公司;采用单因素实验,对四个酶解因素进行考察,四个酶解因素分别为酶解温度:45℃、50℃、55℃、60℃和65℃,加酶量:2500 U/g、
3000 U/g、3500 U/g、4000 U/g和4500U/g,料液比:1:10、1:15、1:20,酶解pH:3、4、5、6和7;
称取3g在步骤(1)中处理后的草鱼鱼鳞溶解于60m1蒸馏水中,按照不同的酶与底物草鱼鱼鳞的比例加入相应量的酶,在一定的温度下水解一定的时间,反应结束后,沸水浴
10min灭酶,收集酶水解的溶液;在4℃、8000r/min条件下用冷冻离心机离心15min,取其上清液。
5.根据权利要求4所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:步骤(3)对上清液的酶解产物分离纯化的具体操作过程为:酶解产物首先选用凝胶色谱进行分离,第一次分离采用的洗脱液为pH7.0的PBS缓冲溶液,流速为0.8mL /min,洗脱峰在225nm下进行测量;收集具有最佳抗冻活性的峰,再用阳离子交换色谱进行分离,第二次分离采用的采用洗脱液为NaCl浓度为0‑0.5M的0.01mol/L pH5.0的醋酸‑醋酸钠缓冲溶液,流速为
0.5mL /min,收集具有最佳抗冻活性的峰,接着再用C18反相HPLC进一步分离,最后收集具有最佳抗冻活性的组分。
6.根据权利要求5所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法,其特征在于:步骤(5)具体过程为:
1)对酵母微生物低温保护效果测定
取1g活性干酵母放入离心管中,与10倍蒸馏水混合,在10℃下震荡20min,然后将抗冻多肽以两个水平0%和0.5%酵母悬浮液分别加入到离心管中震荡,制成酵母悬浮液,分别冻藏3d酵母悬浮液,对酵母菌落进行培养,计算出酵母的存活率;
细胞存活率=100%×(培养出细胞的数量/细胞总数) 2)热滞活性THA的测定
将冻干后的多肽样品配制成20mg/mL的水溶液;取5μL的多肽溶液密封于坩埚内,置于DSC炉体中测定抗冻多肽的THA;初始温度为20℃,以5℃/min的速率降温至‑20℃,保持2 min,再以相同的速率升温至20℃,保持2 min,根据熔融曲线计算多肽溶液的熔融焓Hm 和熔点Tm,然后,以5℃/min速率降温至‑20℃,保持2 min,再以1 ℃/min的速率缓慢升温至样品呈部分熔融状态,这一温度称为保留温度Th,在Th下保持2 min,最后以相同的速率降温至‑20℃;重复上述过程,选取不同的Th,分别按照公式(1)和(2)计算THA和冰晶含量Φ;THA=Th‑To (1)
φ(%)=(1‑(‑∆Hr)/∆Hm)×100 (2)式中,THA指热滞活性,℃;Th指保留温度,℃;T0指起始结晶温度,℃ ;Φ指冰晶含量,%;
∆Hr指结晶焓,J/g;∆Hm指熔融焓J/g。
7.根据权利要求6所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:步骤(6)的具体操作过程为:用LC‑MS/MS 进行检测步骤(5)分离出的具有较强抗冻活性的组分的其氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:步骤(5)通过对抗冻多肽的抗冻活性进行测定,确定最佳酶解条件;得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是:酶采用碱性蛋白酶,酶解温度40‑60℃、酶解时间为3‑5h、酶‑底物草鱼鱼鳞配比为1:10‑1:20(w/w)、酶解pH为4‑6。
9.根据权利要求8所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法,其特征在于:最大抗冻活性的酶解液的酶解条件优选为:酶采用木瓜蛋白酶,底物草鱼鱼鳞浓度5%、pH6、酶解时间3h、酶解温度60°C、加酶量4000U/g。