1.一种普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一、按照普卡那肽序列,通过固相偶联制备片段[13‑4]肽树脂,结构式如下:Cys4‑Glu5‑Leu6‑Cys7‑Val8‑Asn9‑Val10‑Ala11‑Cys12‑Thr13‑树脂;
步骤二、上述[13‑4]肽树脂依次经过巯基脱保护、氧化成环,采用切割剂切割树脂,得到片段一[13‑4,二硫键S‑S(4→12)];
步骤三、按照普卡那肽序列,通过固相偶联制备接头[16‑14]肽树脂,结构式如下:Gly14‑Cys15‑Leu16‑树脂;
步骤四、上述[16‑14]肽树脂与片段一[13‑4,二硫键S‑S(4→12)]固相偶联,得到[16‑
4,二硫键S‑S(4→12)]肽树脂,结构式如下:Cys4‑Glu5‑Leu6‑Cys7‑Val8‑Asn9‑Val10‑Ala11‑Cys12‑Thr13‑Gly14‑Cys15‑Leu16‑树脂,二硫键S‑S(4→12);
步骤五、步骤四所得的经过如下任一种途径得到普卡那肽树脂:途径a:巯基脱保护、氧化成环、得到[16‑4,二硫键S‑S(4→12,7→15)]肽树脂,按照普卡那肽序列,固相偶联剩余氨基酸,得到普卡那肽树脂;
途径b:按照普卡那肽序列,固相偶联剩余氨基酸,得到二硫键S‑S(4→12)普卡那肽树脂;
步骤六、向上述步骤五所得树脂在切割剂的作用下进行切割反应,其中:途径a:采用切割剂切割得到普卡那肽粗品;
途径b:在含选择性脱巯基保护剂及氧化剂的切割剂作用下,得到普卡那肽粗品;
步骤七、普卡那肽粗品经纯化得到纯品。
2.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,制备过程中,肽链上的氨基酸侧链功能团巯基、羧基、羟基、酰胺基以及末端氨基酸的氨基上均具有保护基;
固相偶联时,先脱去末端氨基酸的氨基保护基,然后偶联具有氨基保护基的氨基酸;
氧化成环前或氧化成环时,脱去待成环巯基的保护基;
制备普卡那肽粗品时,脱去所有剩余保护基。
3.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于:步骤一中的片段[13‑4]肽树脂,4位、7位、12位Cys均具有巯基保护基;
步骤二中的片段一[13‑4,二硫键S‑S(4→12)],7位Cys具有巯基保护基;
步骤三中的接头[16‑14]肽树脂,15位Cys具有巯基保护基;
步骤四中的[16‑4,二硫键S‑S(4→12)]肽树脂,7位和15位Cys具有巯基保护基;
制备过程中,所述Thr、Asn、Asp、Glu上均具有保护基,末端氨基酸均具有氨基保护基。
4.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于:步骤一中的片段[13‑4]肽树脂,4位和12位Cys的巯基保护基为Adoc、Boc、Mmt、Mtt或Trt中的一种,优选为Mmt;7位Cys的巯基保护基为Acm、Phacm、Bn或pMeOBn,优选为Acm或Phacm;
步骤二中的片段一[13‑4,二硫键S‑S(4→12)],7位Cys的巯基保护基为Acm、Phacm、Bn或pMeOBn,优选为Acm或Phacm;
步骤三中的接头[16‑14]肽树脂,15位Cys的巯基保护基为Acm、Phacm、Bn或pMeOBn,优选为Acm或Phacm;
步骤四中的[16‑4,二硫键S‑S(4→12)]肽树脂,7位和15位Cys的巯基保护基为Acm、Phacm、Bn或pMeOBn,优选为Acm或Phacm;
所述Thr的保护基为TES、TMS、TBS、DHP、THP、tBu或Trt中的一种,优选为tBu;
所述Asn的保护基为TES、TMS、TBS、tBu或Trt中的一种,优选为Trt;
所述Glu的保护基为ROTES、OTMS、OTBS、ODHP、OTHP、OtBu或OTrt中的一种,优选为OtBu;
所述Asp的保护基为OTES、OTMS、OTBS、ODHP、OTHP、OtBu或OTrt中的一种,优选为OtBu;
末端氨基酸的氨基保护基选自Fmoc。
5.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于:步骤二中,所述巯基脱保护的试剂为TFA/DCM、TFA/TIS/DCM或TFA/PhSMe/DCM混合液中的一种或其中几种的混和物;所述氧化成环采用的氧化剂选自空气、碘、DMSO、双氧水、过氧化叔丁醇中的任意一种或组合;所述巯基脱保护的试剂优选为TFA:DCM=1~8:92~99(体积比),进一步优选为TFA:DCM=1~4:96~99(体积比);或者为TFA:TIS:DCM=1~8:1~20:
72~95(体积比),进一步优选为TFA:TIS:DCM=1~4:4~15:80~95(体积比);或者为TFA:PhSMe:DCM=1~8:1~20:72~98(体积比),进一步优选为TFA:PhSMe:DCM=1~4:4~15:81~95(体积比);
步骤五中,
途径a:所述巯基脱保护、氧化成环形成第二个二硫键S‑S(7→15)一步完成,选择性巯基脱保护试剂为碘,所述氧化成环采用的氧化剂选自空气、碘、DMSO、双氧水、过氧化叔丁醇中的任意一种或组合,反应溶液为MeOH/TIS/DCM、MeOH/PhSMe/DCM或MeOH/DCM混合液中的一种或几种混合物。其中:1)碘的当量为接头肽当量的1~10倍,优选为2~5倍;2)反应溶液优选为MeOH:TIS:DCM=1~8:4~10:72~95(体积比),或者MeOH:PhSMe:DCM=1~8:4~10:
72~95(体积比),或者MeOH:DCM=4~20:84~96(体积比);进一步优选地,反应溶液为MeOH:TIS:DCM=2~5:7~15:80~93(体积比),或者为MeOH:PhSMe:DCM=2~5:7~15:80~
93(体积比),或者为MeOH:DCM=6~15:85~94(体积比)。
6.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,步骤二、步骤六途径a和途径b中,所述的切割剂均选自含有TFA的混合溶剂,其中:步骤二中的切割剂选自TFA/溶剂、TFA/TIS/溶剂、TFA/TFE/溶剂、TFA/TIS/溶剂的混合溶液中的一种或几种混合物;其中,溶剂为水、DMF、DMSO、DCM中的一种或几种混合物,优选DCM;切割剂体积为肽树脂质量的5~20倍,优选为肽树脂质量的5~12倍;
步骤六中,
途径a中的切割剂选自TFA/PhSMe/TIS/水、TFA/PhSMe/水、TFA/TIS/水、TFA/TFE/溶剂、TFA/TIS/EDT/水、TFA/PhSMe/EDT/水的混合溶液中的一种或几种混合物;切割剂体积为肽树脂质量的5~25倍,优选为肽树脂质量的6~15倍;
途径b中的切割剂选自TFA/PhSMe/TIS/水、TFA/PhSMe/水、TFA/TIS/水、TFA/TFE/溶剂、TFA/TIS/EDT/水、TFA/PhSMe/EDT/水的混合溶液中的一种或几种混合物;所述巯基脱保护剂及氧化剂为碘、PhS(O)Ph/MSCl3中的一种或多种组合物;切割剂体积为肽树脂质量的5~
25倍,优选为肽树脂质量的6~15倍。
7.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,步骤二、步骤六途径a和途径b中,所述的切割剂均选自含有TFA的混合溶剂,其中:步骤二中,所述切割剂选自TFA/TIS/水(90~95:1~5:1~5,体积比)的混合溶液;
步骤六中,
途径a:所述的切割剂为TFA/PhSMe/TIS/水(60~97:1~20:1~10:1~10,体积比),比例优选为82~94:8~15:2~5:2~5,进一步比例优选为TFA:PhSMe:TIS:水=90:7:2:1;或者为TFA/PhSMe/水(75~98:1~20:1~5,体积比),比例优选为82~92:8~15:2~4,进一步比例优选为TFA:PhSMe:水=88:10:2;或者为TFA/TIS/水(90~95:1~5:1~5,体积比),比例优选为90:5:5,进一步比例优选为TFA:TIS:水=90:7:3;或者为TFA/TFE/水(90~95:1~
5:1~5,体积比),比例优选为90:5:5;或者为TFA/TIS/EDT/水(95:1~5:1~5,体积比),比例优选为TFA:TIS:EDT:水=88:7:3:2;或者为TFA/PhSMe/EDT/水(83~95:1~15:1~5:1~
5,体积比),进一步比例优选为TFA:PhSMe:EDT:水=90:7:2:1;
途径b:所述的切割剂是在途径a切割剂的基础上,添加了一次性脱保护剂及氧化剂,所述巯基脱保护剂及氧化剂为碘、PhS(O)Ph/MSCl3中的一种或多种组合物。
8.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,步骤一、步骤三、步骤四和步骤五中,所述的固相偶联是在缩合剂的作用下进行的,所述的缩合剂任意独立地选自自BOP/HOBt/NMM、BOP/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOBt/DIEA、DIC/HOOBt、DIC/HOOBt/DIEA、DIC/HOAt、DIC/HOAt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/DIEA、HATU/HOAt/DIEA、TATU/HOAt/DIEA、DIC/HOBt/DMAP、PyAOP/HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyAOP/DIEA、PyBop/DIEA中的一种,优选DIC/HOBt、DIC/HOAt/DIEA、DIC/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HATU/HOAt/DIEA中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,制备过程中,末端氨基酸的氨基保护基选自Fmoc,氨基脱保护的试剂选自Pip/DMF、Pip/DCM、NaOH/MeOH、TEA/DMF中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相制备方法,其特征在于,制备过程中,步骤一、步骤三、步骤四和步骤五中的固相偶联反应溶剂独立地选自DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合。