2+ +

1.一种基于杂交链式‑酶显色反应检测Hg 和Ag的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器包括固定Helper DNA的磁珠、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP2、TMB底物溶液；

所述磁珠为表面原位生长金纳米粒子的溶菌酶修饰的Fe3O4@C纳米材料，记为Fe3O4@C@lyz@Au，lyz代表溶菌酶；

所述固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子记为AuNPs‑HRP‑HP1 DNA；

2+

当检测物为Hg 时，所述Helper DNA的序列为：TGTCTTGGTTTCGGCGTGGGTTTT；

+

当检测物为Ag时，所述Helper DNA的序列为：ACTCTAGCATTCCGCCTGCCTTAA；

所述发夹探针HP1的序列为：GGGGGTTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG；

所述发夹探针HP2的序列为：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述固定Helper DNA的磁珠和固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子均均匀分散于重悬液中，所述重悬液为含3～6wt.％牛血清白蛋白、0.2～0.3wt.％吐温‑20、8～12wt.％蔗糖的20mmol/L Na3PO4水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于：所述磁珠的粒径为150～250nm，金纳米粒子的粒径为15～20nm。

4.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下述步骤：步骤1：设计并合成发夹探针HP1、发夹探针HP2、Helper DNA；

步骤2：制备Fe3O4@C@lyz@Au

将Fe3O4磁性纳米粒子超声分散于葡萄糖水溶液中，在密闭条件下160～170℃反应5～6小时，得到Fe3O4@C纳米材料；将Fe3O4@C纳米材料均匀分散在含溶菌酶和三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的HEPES缓冲溶液中，于37℃下孵育20～40分钟，得到Fe3O4@C@lyz；将Fe3O4@C@lyz超声分散在HAuCl4的乙醇水溶液中，并加入NaBH4，室温反应，得到Fe3O4@C@lyz@Au；

步骤3：Fe3O4@C@lyz@Au固定Helper DNA

在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入Helper DNA和三(2‑羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入Fe3O4@C@lyz@Au，混匀后37℃继续活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到Fe3O4@C@lyz@Au‑Helper DNA；

步骤4：制备AuNPs‑HRP‑HP1 DNA

将金纳米粒子用NaOH水溶液调节pH至6～7，然后加入辣根过氧化物酶，振荡混匀后4℃静置2～3小时，得到修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子；在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入发夹探针HP1和三(2‑羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子，混匀后37℃活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到AuNPs‑HRP‑HP1 DNA。

5.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述Fe3O4@C纳米材料、溶菌酶、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的质量比为1:1～2:6～8。

6.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述Fe3O4@C@lyz、HAuCl4、NaBH4的质量比为1:30～35:3～5。

7.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述Fe3O4@C@lyz@Au、Helper DNA、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1mg:0.12～0.24nmol:1.2～2.4nmol:0.6～1.8μmol。

8.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤4中，所述金纳米粒子、辣根过氧化物酶的配比为2～3nmol:0.1～0.2mg，修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP1、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1nmol:0.5～1nmol:5～10nmol:8～12μmol。

2+ +

9.权利要求1所述的生物传感器在检测Hg 或Ag中的应用，具体检测方法如下：(1)取Fe3O4@C@lyz@Au‑Helper DNA、AuNPs‑HRP‑HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的2+ +

Tris‑HCl缓冲溶液中，然后加入不同浓度Hg 标准溶液或不同浓度Ag标准溶液，振荡混匀后，37℃温育40～60分钟，取出后继续振荡10～20分钟，磁分离去除上清液后，重新分散在pH＝5的醋酸钠缓冲液中，加入TMB底物溶液，反应5～10分钟后，测定652nm处的吸光度；根2+ + 2+ +

据不同浓度Hg 或Ag标准溶液的吸光度值，作Hg 浓度‑吸光度值或Ag浓度‑吸光度值的标准曲线并计算回归方程；

(2)根据步骤(1)的方法测定待测样品的吸光度值，结合回归方程计算待测样品中所含2+ +

Hg 或Ag的浓度。

2+ +

10.根据权利要求9所述的生物传感器在检测Hg 或Ag中的应用，其特征在于：步骤(1)中，将Fe3O4@C@lyz@Au‑Helper DNA、AuNPs‑HRP‑HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的Tris‑HCl缓冲溶液中，使Tris‑HCl缓冲溶液中Helper DNA的终浓度为0.15～0.2μmol/L，Helper DNA、发夹探针HP1、发夹探针HP2的终浓度之比为1:0.4～0.5:0.3～0.5。